卵巢癌為高度異質(zhì)性腫瘤，在婦科惡性腫瘤發(fā)生率排名中位居第三（排名前兩位的依次為子宮內(nèi)膜癌和宮 頸癌），致死率則居?jì)D科惡性腫瘤之首。根據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，全世界每年診斷出的卵巢癌患者約有２３９０００例， 而死于卵巢癌的患者約有１５２０００人。

１材料與方法

１．１ 材料

成年尖吻蝮蛇購(gòu)自湖南省湘西土家族苗族自治州烏龍山，采用咬皿法制備蛇毒，經(jīng)冷凍干燥后置于－２０ ℃ 低溫保存?zhèn)溆谩＃粒玻罚福凹?xì)胞購(gòu)買(mǎi)于 ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。

１．２ 儀器與試劑

本研究所用的主要儀器為：ＧＩ５４Ｄ高壓滅菌器（美國(guó) ＺＥＡＬＷＡＹ 公司）、高溫烘烤箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有 限公司）、超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、ＴＧＬ－１６Ｂ臺(tái)式離心機(jī)（上海迪索儀器有限公司）、ＭＣＯ－１５ＡＣ二 氧化碳培養(yǎng)箱（日本ＳＡＮＹＯ 公司）、ＴＨ４－２００倒置熒光顯微鏡（日本 ＯＬＹＭＰＵＳ公司）、ＴＧＬ－２０高速冷凍離心 機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）和酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó) Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。主要耗材與試劑為：２５ｃｍ２ 細(xì)胞培養(yǎng)瓶和 細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó) Ｃｏｒｎｉｎｇ公 司）、細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 板（上海新睿生物科技有限公司）、Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ／ＤＭＥＭ－Ｈ（美 國(guó) Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（美國(guó) Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司）、ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（美國(guó) Ｓｉｇｍａ公司）、青霉素－鏈霉 素（美國(guó) ＨｙＣｌｏｎｅ公司）、ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（美國(guó) ＨｙＣｌｏｎｅ公司）和 Ｔｒｙｐｓｉｎ０．２５％（１×）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （美國(guó) ＨｙＣｌｏｎｅ公司）。

１．３ 方法

１．３．１ 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng) Ａ２７８０細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液選擇 ＤＭＥＭ 培養(yǎng)基加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１０％的 ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ 和 １００Ｕ·ｍＬ－１的青霉素－鏈霉素，置于３７℃、體積分?jǐn)?shù)為５％的ＣＯ２ 以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Ａ２７８０細(xì)胞 呈貼壁生長(zhǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，有關(guān) Ａ２７８０細(xì)胞的培養(yǎng)液配方以及培養(yǎng)箱中的理化參數(shù)均保持不變。

１．３．２ 不同質(zhì)量濃度蛇毒對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

采用徐平等人的方法并稍作修改：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 Ａ２７８０細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化成懸液，使細(xì)胞密度為２．５×１０５個(gè)·ｍＬ－１，接種于２４孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞 貼壁后棄上清，用ＰＢＳ清洗１次，每孔加入９００μＬ培養(yǎng)液，再加入不同質(zhì)量濃度的蛇毒樣品各１００μＬ，使蛇毒的 終質(zhì)量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，而空白對(duì)照（蛇毒質(zhì)量濃度為０）加入等量的 ＰＢＳ，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１２ｈ，之后拍照記錄細(xì)胞形態(tài)變化。

１．３．３ 不同蛇毒作用時(shí)間對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

仍然采用徐平等人的方法并稍作修改，且在加入蛇毒 前的操作步驟同１．３．２部分；然后加入蛇毒１００μＬ 使蛇毒的終質(zhì)量濃度為５０μｇ·ｍＬ－１，以未加蛇毒為對(duì) 照 （即０ｈ），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)１，６，１２ｈ，并在以上時(shí)間點(diǎn)拍照記錄細(xì)胞形態(tài)變化。

１．３．４ 蛇毒對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞增殖活力的影響

采用ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８）試劑盒檢測(cè)蛇毒對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞增 殖能力的影響，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行如下操作：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 Ａ２７８０細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化成懸液，使細(xì)胞密度 為２．５×１０５個(gè)·ｍＬ－１，接種于９６孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后棄上清；用 ＰＢＳ清洗１次，每孔加入 ９０Ｌ培養(yǎng)液，再加入不同質(zhì)量濃度的蛇毒樣品各１０μＬ，使蛇毒的終質(zhì)量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０， １００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白對(duì) 照（蛇毒質(zhì)量濃度為 ０）加 入 等 量 的 ＰＢＳ，每 組 ６ 個(gè) 復(fù) 孔；再 置 于 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) １２ｈ，每孔加入１０μＬＣＣＫ－８，在培養(yǎng)箱中孵育１ｈ；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于４５０ｎｍ 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，采用以下公式進(jìn) 行細(xì)胞增殖活力的計(jì)算： Ｖ＝Ａ２－Ａ０ Ａ１－Ａ０ ×１００％。 其中：Ｖ 為細(xì)胞增殖活力；Ａ０ 為有培養(yǎng)基、ＣＣＫ－８但無(wú)培養(yǎng)細(xì)胞孔的吸光度；Ａ１ 為有培養(yǎng)細(xì)胞、ＣＣＫ－８、ＰＢＳ孔 的吸光度；Ａ２ 為有培養(yǎng)細(xì)胞、ＣＣＫ－８溶液、蛇毒樣品孔的吸光度。

１．３．５蛇毒對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞粘附能力的影響

在李博等人方法基礎(chǔ)上稍作修改：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 Ａ２７８０細(xì)胞， 經(jīng)胰酶消化成懸液，使細(xì)胞密度為２．５×１０５個(gè)·ｍＬ－１，接種于２４孔板中，加入１００μＬ 不同質(zhì)量濃度的蛇毒樣 品使得蛇毒終質(zhì)量濃度分別為３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００和２００μｇ·ｍＬ－１，空白對(duì)照（蛇毒質(zhì)量濃度為０）加 入等量的ＰＢＳ，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中孵育１２ｈ；再用ＰＢＳ清洗兩次，于顯微鏡下拍照，并隨機(jī)選擇３個(gè)視野進(jìn) 行計(jì)數(shù)（放大倍率為１０×２０倍），以粘附率來(lái)表示 Ａ２７８０細(xì)胞的粘附能力：其中：Ｒ 為粘附率；Ｑ１ 和Ｑ０ 分別為蛇毒處理后的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量和空白對(duì)照的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。

１．３．６ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究所得數(shù)據(jù)均用ｘ珚±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１８．０軟件對(duì)細(xì)胞增殖活力、粘附率等數(shù)據(jù)進(jìn)行單 因素方差分析，當(dāng)ｐ＜０．０５時(shí)，分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

２結(jié)果與分析

不同質(zhì)量濃度的尖吻蝮蛇毒作用于 Ａ２７８０細(xì)胞１２ｈ后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示：空 白對(duì)照 Ａ２７８０細(xì)胞貼壁良好，輪廓清晰，分布均勻，呈規(guī)則形態(tài)；當(dāng)蛇毒質(zhì)量濃度為３．１２５μｇ·ｍＬ－１時(shí)， Ａ２７８０細(xì)胞皺縮、變圓，出現(xiàn)少量凋亡的現(xiàn)象；隨著蛇毒質(zhì)量濃度的增加，大量 Ａ２７８０細(xì)胞皺縮、變圓、黏 連成團(tuán)，出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。以上結(jié)果說(shuō)明尖吻蝮蛇毒可誘導(dǎo) Ａ２７８０細(xì)胞凋亡，且兩者呈劑量依賴(lài) 關(guān)系，即：蛇毒劑量越大，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯。為探究不同時(shí)間條件下尖吻蝮蛇毒對(duì) Ａ２７８０細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響，選用５０μｇ·ｍＬ－１的蛇毒作用于 Ａ２７８０ 細(xì)胞，結(jié)果如圖２所示：未加蛇毒時(shí)，Ａ２７８０細(xì)胞貼壁良好，輪廓清晰，分布均勻，呈規(guī)則形態(tài)；當(dāng)蛇毒處理 Ａ２７８０細(xì)胞１ｈ時(shí)，少量被處理細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓的現(xiàn)象；當(dāng)蛇毒處理 Ａ２７８０細(xì)胞６ｈ時(shí)，大量被處理 細(xì)胞皺縮、變圓的現(xiàn)象；當(dāng)蛇毒處理 Ａ２７８０細(xì)胞１２ｈ時(shí)，被處理細(xì)胞粘連成團(tuán)并大量出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。以 上結(jié)果說(shuō)明尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo) Ａ２７８０細(xì)胞凋亡的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯。

３討論

腫瘤細(xì)胞主要特征是無(wú)限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，涉及許多調(diào)控因子、細(xì)胞因子 等之間的相互作用———這是導(dǎo)致腫瘤惡性發(fā)展的主要原因。細(xì)胞之間粘附能力的變化是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的初始階段， 并有助于腫瘤細(xì) 胞 從 原 發(fā) 部 位 脫 落，侵潤(rùn)周?chē)慕M織，啟 動(dòng) 轉(zhuǎn) 移 程 序。本 研 究 中，經(jīng)尖吻蝮蛇毒處理的 Ａ２７８０細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化：細(xì)胞變小、變圓、皺縮，且蛇毒質(zhì)量濃度及時(shí)間與 Ａ２７８０細(xì)胞的形態(tài)變化呈劑 量依賴(lài)關(guān)系。Ａ２７８０細(xì)胞形態(tài)的變化可能是由于尖吻蝮蛇毒破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而影響了維持細(xì)胞正常形態(tài)的 功能。當(dāng)尖吻蝮蛇毒的質(zhì)量濃度為２５μｇ·ｍＬ－１時(shí)，Ａ２７８０細(xì)胞活力低于５０％，顯示蛇毒對(duì)該細(xì)胞具有明顯 的抑制細(xì)胞增殖作用。蛇毒抑制癌細(xì)胞增殖主要通過(guò)兩個(gè)途徑：一是上調(diào)抑癌基因表達(dá)與下調(diào)促癌基因表達(dá)， 二是阻滯細(xì)胞周期。但尖吻蝮蛇毒抑制 Ａ２７８０細(xì)胞增殖的具體途徑還有待進(jìn)一步的研究。在本研究中，當(dāng) 尖吻蝮蛇毒質(zhì)量濃度高于６．２５μｇ·ｍＬ－１時(shí)，Ａ２７８０細(xì)胞粘附率銳減，其中原因有可能是蛇毒引起受處理細(xì)胞 的緊密連接蛋白表達(dá)異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞連接完整性被破壞，繼而使細(xì)胞之間粘附能力。然而，尖吻蝮蛇 毒影響 Ａ２７８０細(xì)胞粘附的分子機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。