三葉青（ｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、石抱子等，為葡萄科崖爬藤 屬植物三葉崖爬藤。它主要分布于中國(guó)浙江、安徽、江西、云南、貴州等地，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活 血化瘀等功效。三葉青中含有多種有效的化學(xué)活性成分，多糖便是其中之一。研究表明，三葉青多糖 具有復(fù)雜的生物活性和功能，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、調(diào)節(jié)免疫等。目前研究人員提取三 葉青多糖的方法大多為傳統(tǒng)的水提醇沉法、酸堿提取法、索氏提取法等，這些傳統(tǒng)的提取方法普遍存在 提取溫度高、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、溶劑消耗大且多糖的空間結(jié)構(gòu)易被破壞等缺點(diǎn)。

１ 材料與儀器

１．１ 材 料

纖維素酶（ＢＲ，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)２０１８０３０９）；葡萄糖（ＡＲ，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；鹽 酸（ＡＲ，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；硫酸（ＡＲ，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（ＡＲ，杭州雙林化工試 劑廠）；１，１－二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ，ＡＲ，北京冬歌生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇（ＡＲ，永華化學(xué)科技有限公 司）；ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（ＡＲ，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水楊酸（ＡＲ，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；３０％Ｈ２Ｏ２ 溶 液（ＡＲ，杭州高晶精細(xì)化工有限公司）；三葉青塊根（浙江麗水三葉青珍稀植物研究所，產(chǎn)地浙江麗水）。

１．２ 儀 器

高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司，ＣＳ－７００）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限 公司，ＢＳ２２４Ｓ型）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司，ＳＨＺ－ＤⅢ型）；電熱恒溫水浴鍋（杭州藍(lán)天 化驗(yàn)儀器廠，ＤＫＳ－２４型）；７５２紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；冰箱（博西華家用電 器有限公司，ＢＣＤ－２１２型）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，９０７０ＭＢＥ 型）；ｐＨ 計(jì) （上海佑科儀器儀表有限公司，ＰＨＳ－３Ｃ型）。

２ 試驗(yàn)方法

２．１ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

２．１．１ 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖５０ｍｇ于２５０ｍＬ容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配 得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）。

２．１．２ 最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸?。保埃恚痰钠咸烟菢?biāo)準(zhǔn)溶液，置于１０ｍＬ具塞試管中，加去離子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液 １．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ濃硫酸混勻，靜止１０ｍｉｎ，搖勻，室溫放置２０ｍｉｎ。同時(shí)?。玻埃恚倘ルx子 水作為空白對(duì)照。在分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)４５０～５５０ｎｍ 處的吸光度，確定其最大吸收波長(zhǎng)。根據(jù) 試驗(yàn)結(jié)果，吸收波長(zhǎng)為４９２ｎｍ 時(shí)，樣品溶液的吸光度最大，故本試驗(yàn)選取的吸收波長(zhǎng)為４９２ｎｍ。

２．１．３ 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＬ，置于１０ｍＬ具塞試管 中，加去離子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液１．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ濃硫酸混勻，靜止１０ｍｉｎ，搖 勻，室溫放置２０ｍｉｎ。同時(shí)?。玻埃恚倘ルx子水作為空白對(duì)照，按上述方法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)其 吸光度，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

２．２ 纖維素酶法提取三葉青多糖的工藝流程

將三葉青塊根用粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取三葉青粉末５．０ｇ及適量的纖維素酶，加入一定量的稀酸液 并結(jié)合ｐＨ 計(jì)調(diào)節(jié)溶液ｐＨ 值為５，在一定溫度條件下提取三葉青多糖。一段時(shí)間后將其置于９０ ℃水浴 鍋中滅活５ｍｉｎ，再經(jīng)過(guò)抽濾得到濾液，將濾液于２５０ｍＬ 容量瓶中定容，以用于接下來(lái)多糖提取率的測(cè)定。

２．３ 三葉青多糖提取率的測(cè)定

三葉青多糖提取率的測(cè)定采用苯酚－硫酸法。從２５０ｍＬ容量瓶中?。保埃恚淘囈河冢保埃恚倘萘?瓶中并定容。再?gòu)模保埃恚倘萘科恐芯芤迫。埃担恚贪矗玻保车姆椒y(cè)定樣品吸光度，并按式（１）計(jì)算 三葉青多糖的提取率： Ｙ ＝ ［（Ｃ×Ｖ ×Ｄ）／Ｍ］×１００％。 （１） 式（１）中：Ｙ 為多糖提取率；Ｃ 為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的多糖質(zhì)量濃度，ｍｇ／ｍＬ；Ｖ 為待測(cè)液體積，ｍＬ；Ｄ 為稀釋倍數(shù)；Ｍ 為樣品質(zhì)量，ｍｇ。

２．４ 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在酶法提取三葉青多糖的過(guò)程 中，影響多糖提取率的主要因素 有酶 加 量、酶 解 時(shí) 間、酶 解 溫 度、 ｐＨ、水料比（體積∶質(zhì)量，ｍＬ／ｇ）、提取次數(shù)等。本試驗(yàn)選擇酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、水料比這 ４個(gè)因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過(guò)多次的預(yù)試驗(yàn)，對(duì)各單因素條件的固定提取條件進(jìn)行了設(shè)置，具體見(jiàn)表１。

３ 試驗(yàn)結(jié)果與分析

以吸光度ｙ值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度ｘ 為橫坐 標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖１所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸 方程為：ｙ＝５７．７６７ｘ－０．０１７，Ｒ２ ＝０．９９９４，表明吸光度 在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為０．００５～０．０３ｍｇ／ｍＬ范 圍內(nèi)線性關(guān)系較好。隨著酶加量的增加，三葉青多糖提取率 增大，這一階段影響三葉青提取率的主要因素是酶含量。當(dāng)酶加量達(dá)到０．３％時(shí)，三葉青多糖提取率達(dá)到最大；之后再增大酶加量，三葉青多糖提取率反而有所降低。這是因?yàn)榇藭r(shí)影響三葉青多糖提取率的 圖２ 酶加量對(duì)三葉青多糖提取率的影響 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ 主要因素是底物的量，此時(shí)酶的用量已達(dá)到飽和，沒(méi)有多 余的底物再有機(jī)會(huì)與纖維素酶反應(yīng)；而且酶含量過(guò)高，也 可能會(huì)抑制酶的作用。因此，酶加量?。埃常?。

4 結(jié) 語(yǔ)

采用纖維素酶法提取三葉青中的多糖，考察了酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間及水料比４個(gè)因素對(duì) 多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，明確了各因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響大小 次序?yàn)椋好讣恿浚舅媳?＞ 酶解時(shí)間 ＞ 酶解溫度。最佳提取工藝條件為：酶加量 ０．２７４％，酶解溫度 ６０．５ ℃，酶解時(shí) 間 ６２．４ ｍｉｎ，水 料 比 ２５．８∶１，此 條 件 下 的 多 糖 實(shí) 際 提 取 率 為 １０．４７％。酶法提取三葉青多糖用時(shí)較短，提取率卻更高。本試驗(yàn)得出的三葉青多糖提取優(yōu)化工藝可為研 究與開(kāi)發(fā)三葉青多糖提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。



 

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