茄子（Solanum melongena）是亞洲和非洲許 多國家重要的蔬菜作物之一，在我國各地普遍栽 培。茄子作為一種喜溫性蔬菜，大多茄子品種不 抗寒。近年來，人們采用節(jié)能型塑料日光溫室 和塑料大棚在冬春反季節(jié)栽培茄子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

將T40茄子6葉齡幼苗放在3 ℃ 低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，于 0、2、6、12 h 分別 取樣。將茄子第 5 片真葉取下立即投入液氮中， −80 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
1.1.2 試劑與菌株

ExTaq、pMD18-T、T4 DNA 連接酶載體購自 TaKaRa 公司；柱式 DNA 膠回收 試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；SYBR ExScriptTM RT-PCR 購自 TaKaRa 公司；引物由上 海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。通用 RNA 提取試 劑盒 R1051 購自廣州東盛生物科技有限公司。 E. coli DH5α 菌株由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。其余為 國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 茄子

CBF基因的克隆與生物信息學(xué)分析 將白菜（Brassica rapa）CBF 基因序列（登錄號： KJ013591.1）搜索茄子基因組 DNA 序列，用 softberry 網(wǎng)站在線預(yù)測基因軟件 FGENESH 對這 段 DNA 序列進(jìn)行基因預(yù)測，找到 CBF 基因的編碼區(qū)。參考茄子 EST 序列，通過與小白菜（Brassica campestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬 鈴薯（Solanum tuberosum）CBF 基因序列比對確 定茄子 CBF 的開放型閱讀框區(qū)域（Open Reading Frame, ORF），并在此序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì) ORF 上下 游引物和熒光定量引物（表 1）。

參考 RNA 提取試劑盒步驟提取茄子葉片總 RNA，將 500 ng RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。吸取 cDNA 1 μL 作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，25 μL PCR 反應(yīng)體系包含 2.5 μL Ex buffer，2 μL dNTPs，0.2 μL ExTaq，0.5 μL 引物，1 μL cDNA，ddH2O 補(bǔ) 充至 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性 3 min；35 個擴(kuò)增循環(huán)的 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min；最后 72 ℃繼續(xù)延伸 7 min。然后， 將 PCR 產(chǎn)物用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含 有目的條帶片段割膠回收，再連接 pMD18-T 載 體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克 隆送到鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

NCBI 上用白菜 CBF 基因序列（登錄號： KJ013591.1）搜索茄子 Whole-genome shotgun contigs ，發(fā)現(xiàn)該序列與茄子 contig: Sme2.5_ 04750.1_1（登錄號：BAUE01047055.1）相似度 最高，達(dá) 71%。在 softberry 網(wǎng)站，以番茄基因組 DNA 為參照，用 FGENESH 軟件對該序列進(jìn)行基 因預(yù)測，在 1023~2137 bp 之間有 1 個沒有內(nèi)含子 的基因。將該基因序列與 Genbank 登錄的基因組 序列，以及 3 個 EST 序列（EST1：FS056692.1； EST2：JZ716995.1；EST3：FS057826.1）進(jìn)行比 對，設(shè)計(jì) ORF 引物 CBF-U 與 CBF-D。以茄子葉片 cDNA 為模板，用 CBF-U 和 CBF-D 引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長約 700 bp 的片段。經(jīng)回收、測序長 699 bp，與基因組 DNA 序 列完全一致。將此序列及其編碼的氨基酸序列與 其他物種 CBF 比較，發(fā)現(xiàn)有較高同源性，該序列 （ Solanum melongena ， AVC18973.1 ）與辣椒 （Capsicum annuum，NP_001311786.1）、煙草 （Nicotiana tabacum，NP_001312746.1）、番茄（Solanum lycopersicum，XP_004234350.1）、馬 鈴薯（Solanum tuberosum，ACJ26754.1）和葡萄 （Vitis vinifera，XP_002280097.1）的 CBF 蛋白同 源性為 71.17%、70.09%、65.93%、63.76%、62.84% 。因此確認(rèn)獲得了茄子 CBF 基因全長 cDNA 序列，將其命名為 SmCBF，GenBank 登錄 號為 KY780486.1。


3 討論

低溫逆境是影響植物生長發(fā)育和分布的主要因素之一，每年因寒害造成的園藝作物的減產(chǎn)和 品質(zhì)下降是目前園藝植物生產(chǎn)中亟待解決的一大 難題。植物的抗寒性一般受多基因控制，且與品 質(zhì)優(yōu)劣性狀緊密連鎖，因此采用常規(guī)雜交育種很 難提高植物抗寒性。利用基因工程改良植物的抗 逆性為抗性育種開辟了新途徑，因此抗逆基因的 克隆與分析就顯得極為重要。



 

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