咳嗽是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ?jiàn)的一種現(xiàn)象，它是人體的 一種應(yīng)激反應(yīng)，目前，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，相關(guān)文獻(xiàn) 報(bào)道稱咳嗽或者與氣道炎癥反應(yīng)、氣道黏膜損傷等因素有干系。呼 吸 道 合 胞 體 病 毒 ( respiratory syncytial virus， ＲSV) 是一種常見(jiàn)的冬季呼吸道病毒，影響所有年齡段的 人，是幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的主要原因。然而，ＲSV 在成 人中也是一種重要的病原體，特別是在老年人、慢性肺部疾 病患者或免疫功能受損的人群中。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為病毒 感染導(dǎo)致了氣道變應(yīng)性炎癥、氣道上皮損傷、氣道高反應(yīng)等。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)豚鼠，雌性，體質(zhì)量 300 ～ 450 g，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào): SYXK( 遼) 2012 － 0003。

1． 2 主要試劑及儀器

1． 2． 1 射干及提取物制備

射干藥材購(gòu)自亳州市星躍藥 業(yè)有限責(zé)任公司，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)植物教研室王冰教授 鑒定為鳶尾科射干 Belamcandachinensis( L． ) Ｒedouté 的干 燥根莖。射干提取物的制備: 取射干片加 70% 乙醇，回流 提取 3 次，第 1 次加 8 倍量，第 2 次和第 3 次分別加 6 倍 量，每次提取 1 h，趁熱濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮成 稠膏，干燥，粉碎成細(xì)粉。

1． 2． 2 試劑

肺寧片購(gòu)自吉林吉春制藥股份有限公司 ( 20140206) ; Hep － 2 人喉表皮癌細(xì)胞購(gòu)自江蘇齊氏生物科 技有限公司; ＲSV 由中科院武漢病毒所贈(zèng)予; DMEM 培養(yǎng) 液和胎牛血清購(gòu)自 COＲNING 公司; DMSO 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; 胰酶和青鏈霉素購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究 所; 色譜級(jí)醋酸銨、色譜級(jí)甲醇和色譜級(jí)乙腈購(gòu)自德國(guó)默克 公司; Cis － 5，8，11，14 － Eicosic Acidtraenoic Acid ( AA) ( 批 號(hào): U － 71A － F2 － Z) 和 Arachidonic Acid － d8 ( AA － d8) ( 批號(hào): 0465985 － 16) 購(gòu)自美國(guó) Cayman Chemical 公司。

1． 2． 3 主要儀器

噴霧儀( EM99 － 002，惠州斯萊達(dá)) ; 全 自動(dòng)模塊式血液體液分析( XN － 1000，日本 Sysmex 公司) ; 熏煙箱( 自制) ; 三氣培養(yǎng)箱( CB210，德國(guó) Binder) ; 倒置熒 光顯微鏡( XDS － 500C，上海蔡康) ; 超凈工作臺(tái)( SW － CJ － 2D，蘇州凈化) ; 低速離心機(jī)( BY － 400C，北京白洋) ; 立式蒸汽滅菌器( BXM-30R，上海博訊) ; LC － MS /MS 聯(lián)用儀 ( Agilent6410 型，美 國(guó) Agilent) ; 微型旋渦混合儀 ( XW － 80A，上海滬西) ; 分析天平( XS105，瑞士 Mettler － Toledo) ; 超純水機(jī)( Milli － Q，德國(guó)默克) 等。

1． 3 實(shí)驗(yàn)方法

1． 3． 1 病毒培養(yǎng)

Hep － 2 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至 70% ～ 80% 融合，吸出培養(yǎng)基，取病毒懸液 100 μL 接種于細(xì)胞上， 吸附 2 h 后倒出病毒液，加入 5% 胎牛血清的培養(yǎng)基，于第 2 ～ 3 天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變( CPE) ，待病變達(dá) 60% ～ 70% 時(shí) 收獲病毒，細(xì)胞病變法( cytopathic effect，CPE) 測(cè)定病毒感 染滴 度，Ｒeed － Muench 公式計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染量 ( TCID50 ) 。1 TCID50≈0． 7 空斑形成單位( plaque forming unit，pfu) 。

1． 3． 2 感染后咳嗽模型的制備

將豚鼠放入自制 450 mm × 450 mm × 900 mm 熏籠中，每 5 只 1 籠，以鋸末 50 g + 10 支香煙點(diǎn)燃煙熏，每次 30 min，每日 1 次，連續(xù) 7 d，自由 進(jìn)食吸水，分別在第 2 天、第 3 天用乙醚淺麻醉 1 次，鼻腔 滴入已事先擴(kuò)增凍存好的病毒液，病毒滴度為 8 × 106 pfu / mL，滴入量以體質(zhì)量 1 μL/g 計(jì)算。

1． 3． 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

將 40 只 SPF 級(jí)豚鼠適 應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為 4 組，即空白組、模型組、射干組 ( 600 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，陽(yáng)性組( 肺寧片 512 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，每組 10 只。按“1． 3． 2”制備感染后咳嗽動(dòng)物模型， 除模型組外，其它各給藥組在第 8 天時(shí)開(kāi)始給藥，每天 1 次，連續(xù)給藥 7 d，空白組給予等體積生理鹽水。

1． 3． 4 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鎮(zhèn)咳作用的觀察

于末次給藥 45 min 時(shí)，將動(dòng)物置于 5 L 大燒杯中，底部加少量墊料，燒杯口用 保鮮膜封，以 4． 5 mol /L 枸櫞酸溶液霧化吸入激發(fā)，每次 30 s，觀察 5 min 內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)。

2 結(jié)果

除空白組外，各組的肺組織均漿液在 Hep － 2 細(xì)胞上 培養(yǎng)至第 2 天細(xì)胞開(kāi)始逐漸腫脹、變圓和聚集，細(xì)胞間隙增 大，第 4 天形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。提示 ＲSV 病毒 感染成功。模型組豚鼠的咳嗽潛 伏期無(wú)顯著差異( P ＞ 0. 05) ，而 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著高于 空白組( P ＜ 0. 01) ，提示造模成功。與模型組相比，給藥組 中，射干組和陽(yáng)性組豚鼠 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著降低( P ＜ 0. 05) ，陽(yáng)性組豚鼠 5 min 后咳嗽次數(shù)顯著下降( P ＜ 0. 05) ， 提示射干提取物對(duì)豚鼠 ＲSV 感染后氣道炎癥具有顯著的 鎮(zhèn)咳作用?？瞻捉M鏡下肺組織和肺泡結(jié)構(gòu)正常， 有完整的支氣管上皮，黏膜較光滑，各層的結(jié)構(gòu)比較清晰， 在支氣管壁內(nèi)側(cè)未見(jiàn)到炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn); 模型組在鏡下觀 察到顯著地支氣管、支氣管周圍炎癥，其血管周圍有很多炎 性細(xì)胞浸潤(rùn)，觀察到支氣管黏膜充血水腫，管腔內(nèi)有上皮細(xì) 胞脫落，有纖毛倒伏上皮現(xiàn)象，明顯可見(jiàn)中性粒細(xì)胞和淋巴 細(xì)胞有圍管性浸潤(rùn); 而射干組和陽(yáng)性組與模型組比較，支氣 管和周圍炎癥較上述病理變化均有所減輕，提示射干提取 物對(duì)呼吸道合胞病毒感染后氣道肺組織損傷有一定的治療 作用。

3 討論

感染后咳嗽又稱為“感冒后咳嗽”，是指呼吸道 感染發(fā)熱等急性期癥狀消失后，咳嗽仍遷延不愈，可持續(xù) 3 ～ 8 周的時(shí)間，呈喉癢、干咳或咳少量白色黏液痰，血常規(guī)、 C 反應(yīng)蛋白、胸片提示無(wú)異常，是呼吸道感染后常見(jiàn)的并發(fā) 癥。西醫(yī)認(rèn)為該病為自限性疾病，很多權(quán)威學(xué)者一致認(rèn) 為炎癥因素、氣道上皮損傷、氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)因素等是 感染后咳嗽的發(fā)病機(jī)制，通常經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間自行緩解或予經(jīng) 驗(yàn)性治療可愈。



 

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