將 3 mL 0. 1 g /L L-多聚賴氨酸溶液注入用于 接種細(xì)胞的 T75 培養(yǎng)瓶中過夜，用無菌 PBS 洗 3 次，每次 10 min，常溫，置于無菌超凈臺內(nèi)，1 h 內(nèi) 接種細(xì)胞。用于差速粘附及傳代的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng) 皿無需此處理。眼科彎鑷、直鑷及彎剪需提前浸 泡酒精，高壓烘干。將細(xì)胞懸 液接種至未用多聚賴氨酸處理過的 T75 培養(yǎng)瓶 中，37 ℃、5% CO2 培養(yǎng) 15 min，吸出剩余未貼壁 的星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液，輕柔吹打混勻后，將細(xì)胞以 5× 106 /mL 接種至多聚賴氨酸包被預(yù)處理過的 T75 培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)。每隔 3 d 換液， 待細(xì)胞融合到 90%左右時，進(jìn)行下一步操作。 細(xì)胞長滿 瓶 底 后，更換完全培養(yǎng)基，37 ℃ 恒 溫 搖 床 200 r /min振蕩 18 h。將培養(yǎng)瓶中上清液迅速倒 掉，用 PBS 洗 3 次，將每瓶細(xì)胞加入 1 mL 0. 25% 胰蛋白酶 37 ℃ 消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞 突觸回縮、大部分細(xì)胞脫落時，加入完全培養(yǎng)基終 止消化。反復(fù)吹打瓶壁，收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)或 傳代。

將第一代( P1) 、第二代( P2) 、第三代( P3) 細(xì) 胞消化后取 100 μL 接種于 96 孔板中培養(yǎng) 4 h，加 入 MTS 溶液 20 μL 后，繼續(xù)在 37 ℃、5%CO2 博訊常溫培養(yǎng)箱（上海博迅HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱）內(nèi)孵育 4 h。每組重復(fù) 3 次，酶標(biāo)儀檢測 λ = 490 nm 條件下吸光度值( A) 。免疫熒光法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志 GFAP，GFAP 陽性細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色 熒光，DAPI 染色后所有細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，可見細(xì)胞胞體較大、突觸較長。隨機(jī)選取 3 個視野，計算陽性率為( 97. 86±0. 91) %。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的分裂高峰發(fā)生在動物胚胎晚 期及出生以后，同時大腦皮層中混雜的神經(jīng)元在 出生后不再增殖，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞的來源一般 選擇新生哺乳動物。由于出生 1 d 內(nèi)鼠腦較小， 大腦皮層不易剝離，且出生 3 d 后大鼠大腦溝回 開始形成，軟腦膜與腦組織不易剝離，會造成軟 腦膜中成纖維細(xì)胞的干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選取出 生 2 d 的 SD 大鼠作為細(xì)胞來源。生 2 d 的 SD 大鼠作為細(xì)胞來源。 此外，0. 25%胰蛋白酶消化組織的時間可影 響星形膠質(zhì)細(xì)胞純度及增殖活力，消化 40 min 時 細(xì)胞會有明顯損傷，因此本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制消化時 間在 15 min。值得注意的是，雖然目前大多數(shù)研 究者使用 0. 25%胰蛋白酶消化組織制備單細(xì)胞 懸液，但其中的胰蛋白酶添加量并未提及。本 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰酶添加量取決于組織塊的大小，添加 量過多會導(dǎo)致細(xì)胞過度消化，添加量過少導(dǎo)致組 織消化不充分。因此本實(shí)驗(yàn)將胰蛋白酶添加量設(shè) 定為每 2 只鼠腦皮質(zhì)加入 500 μL 胰蛋白酶，可避 免細(xì)胞消化過度，導(dǎo)致大部分細(xì)胞死亡。 差速貼壁法和恒溫振蕩法為星形膠質(zhì)細(xì) 胞培養(yǎng)中最常用的方法。差速貼壁法利用了成纖 維細(xì)胞貼壁時間短，星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁時間長的 特性，可以很好地分離兩種細(xì)胞。在部分研究中采用恒溫振蕩法以去除附著的小膠質(zhì)和 少突膠質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞置于 37 ℃ 恒溫箱中，以 250 r /min 的速度進(jìn)行振蕩，雖然能夠起到純化作 用，但得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相對減少，因此本 實(shí)驗(yàn)采用 200 r /min 的速度恒溫振蕩 18 h，得到相 對較多且純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞。