反流性食管炎 ( reflux esophagitis，ＲE) 是胃 液或混合腸液反流刺激等原因引起的食管黏膜炎性 病變，可導(dǎo)致食管黏膜出血、食管狹窄、吞咽困難等。近年來，ＲE 的發(fā)病率有不斷上升的趨勢， 其并發(fā)癥 Barrett 食管、食管腺癌等已成為消化領(lǐng) 域的研究熱點(diǎn)。目前一過性食管下括約肌松弛 被認(rèn)為是引起 ＲE 的最主要因素，可能與平滑肌細(xì) 胞中的游離 Ca2 + 濃度有關(guān)。另外，亦有研究顯示，5-羥色胺 ( 5-HT) 是參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng) 和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)。ＲE 屬于中醫(yī)學(xué) “吞 酸” “吐酸” “嘈雜” “胃脘痛” “食管癉”等范 疇。研究顯示，旋覆代赭湯治療 ＲE 療效顯著。 本研究觀察旋覆代赭湯對食管平滑肌細(xì)胞 ( ESMC) 中 5-HT、Ca2 + 的影響，探討旋覆代赭湯治療 ＲE 的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠 45 只，8 周齡，體質(zhì) 量 ( 220 ± 20) g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào): SCXK ( 滬) 2013- 0016。本研究通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審 批，批件號(hào): ZSLL-2016-130。

1. 2 藥物

旋覆代赭湯根據(jù)其在 《傷寒論》中原方的劑 量換算: 旋覆花 15 g，赭 石 5 g，清 半 夏 15 g， 生姜 25 g，人參 10 g，炙甘草 15 g，大棗 15 g，由 浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供，水煎濃縮成含生藥量 1 g /ml 的藥液，置冰箱中 4℃保存。

1. 3 主要試劑及儀器

胎牛血清 ( 批號(hào): 20150520) ，杭州四季青生 物工程材料有限公司; DMEM 培 養(yǎng) 基 ( 批 號(hào): 1897299) ，Sigma 公司; 平衡鹽溶液 ( Hanks 液， 批號(hào): 20170331) ，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司; 磷酸緩沖鹽溶液 ( PBS，批號(hào): 02 /2019) 、CCK-8 試劑盒 ( 批號(hào): D824FD0251) 、大鼠蛋白激酶 A ELISA 試劑盒 ( 批號(hào): 201710) ，均購自上海生工 生物工程有限公司; FITC-羊 抗 兔 IgG ( 批 號(hào): BST12E02A05 ) 、 FITC-羊 抗 小 鼠 IgG ( 批 號(hào): BST12E02A01) 、5-羥色胺 4 受體 ( 5-HT4Ｒ) 抗體 ( 批號(hào): 003112A81113) 、兔抗大鼠 α 平滑肌激動(dòng)蛋 白 ( α-SMA， 批 號(hào): 4A4 ) 、 羊 血 清 ( 批 號(hào): 13B01A09) 、DAPI 染液 ( 批號(hào): 12D20B77) 、4% 多 聚甲醛 ( 批號(hào): 12G30B69) ，武漢博士德生物工程 有限公司; 馬來酸替加色羅 ( 批號(hào): 189188-57-6) ， 上海陶素生化科技有限公司 ; GＲ113808 ( 批號(hào): 3A/203952 ) ， TOCＲIS 公 司; Forskolin ( 批 號(hào): 15771 ) 、 SQ22536 ( 批 號(hào): 22969 ) ， Medchem Express 公 司; 大 鼠 cAMP ELISA 試 劑 盒 ( 批 號(hào): 1803251) ，上海西唐生物科技有限公司; 免疫染色 通透液 ( 0. 2% Triton X-100，批號(hào): P0096) 、鈣離 子熒光探針 ( Fluo-3 /AM，批號(hào): 09011711207) ，上 海碧云天 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司; 水 合 氯 醛 ( 批 號(hào): I1607002) ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 上海博迅BSC-1000A2生物安全柜； 3111 型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Heraeus Multifuge X1Ｒ 型 高速離心機(jī)，Thermo 公司; 30050303 型多功能酶 標(biāo)儀，TECAN 公司; DS-Ｒi2 型高級(jí)分析倒置顯微 鏡，Nikon 公 司; LSM880 型 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡， ZEISS 公司。

1. 4 原代細(xì)胞提取

采用隨機(jī)數(shù)表法取 5 只大鼠用于分離正常大鼠 原代 ESMC，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食未禁水 24 h，10% 水合氯醛 0. 35 ml /100 g 腹腔注射麻醉，腹部正中 剪開，暴露腹腔，分離食管下端，剪斷并獲取食管 下 1 /3，立即放入呈有 PBS 的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿 移入超凈臺(tái)內(nèi)，用 PBS 沖洗 3 次，剝離食管黏膜、 漿膜等雜質(zhì)。轉(zhuǎn)移呈有 DMEM 的培養(yǎng)皿中，將其 剪成約 1 mm2 的小塊。再用巴氏吸管將組織懸液移 入 15 ml 離心管，室溫 800 r /min 離心 5 min，離心 半徑 8 cm。離心完畢，棄去上清液，加入約 2 ml 含 FBS 重 懸 組 織，移 入 25 cm2 培養(yǎng) 瓶 中，吸 去 FBS，將培養(yǎng)瓶倒置于 37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 4 ～ 5 h，待組織牢固貼于培養(yǎng)瓶上，加入 20% FBS DMEM 培養(yǎng)基 3 ml 培養(yǎng)，隔 3 天換 1 次液。

2 結(jié)果

原代培養(yǎng)的 ESMC 培養(yǎng) 3 ～ 4 天有少量細(xì)胞從 組織塊周圍爬出，2 周時(shí)細(xì)胞生長為單層，鋪滿瓶 底，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，成梭形、三角形或菱形，4 周時(shí)細(xì)胞排列致密，呈 “峰谷樣”生長。ESMC 中 α-SMA 呈陽性，細(xì)胞純度較高。在 5% 、10% 、20% 、30% 藥物濃度 下，旋覆代赭湯低、中劑量組對 ESMC 干預(yù)后 OD 值較空白組均升高 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，而旋 覆代赭湯高劑量組僅在 5% 濃度下 OD 值較空白組 升高，并 且 在 30% 濃 度 下 OD 值 較 空 白 組 降 低 ( P ＜ 0. 01) 。旋覆代赭湯低劑量組在 5% 、10% 、 20% 、30% 藥物濃度下增殖率分別為 188. 68% 、 152. 49% 、168. 36% 、137. 5% ，旋覆代赭湯中劑 量 組 分 別 為 153. 28% 、 155. 66% 、 138. 12% 、 132. 73% ，旋覆代赭湯高劑量組分別為 168. 24% 、 122. 07% 、84. 13% 、71. 80% ，提示 5% 旋覆代赭 湯低劑量組對 ESMC 的增殖作用最強(qiáng)，故選取用于 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與空白血清組比較，中 藥 組、5- HT4Ｒ 激動(dòng)劑組和 5-HT4Ｒ 抑制劑組的 5-HT4Ｒ 熒光 強(qiáng)度顯著增加，中藥組和 5-HT4Ｒ 激動(dòng)劑組、AC 激動(dòng)劑組 Ca2 + 熒光增強(qiáng)比值及 cAMP 濃度顯著增 加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。與 5-HT4Ｒ 激動(dòng)劑組比 較，5-HT4Ｒ 激動(dòng)劑加中藥組 Ca2 + 熒光增強(qiáng)比值增 加( P ＜ 0. 0 1 ) 。與AC激 動(dòng) 劑 組 比 較，AC激 動(dòng) 劑加中藥組 5-HT4Ｒ 熒光強(qiáng)度、Ca2 + 熒光增強(qiáng)比值顯 著增 加 ( P ＜ 0. 01) 。與 5-HT4Ｒ 抑制 劑 組 比 較， 5-HT4Ｒ抑制劑加中藥組 5-HT4Ｒ 熒光強(qiáng)度、Ca2 + 熒 光增強(qiáng)比值、cAMP 濃度均增加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。與 AC 抑制劑組比較，AC 抑制劑加中藥組 5-HT4Ｒ 熒光強(qiáng)度、Ca2 + 熒光增強(qiáng)比值、cAMP 濃 度均增加 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ＲE 多由于素體稟賦不足或飲食 不節(jié)、情志失調(diào)、久病不愈、勞倦內(nèi)傷等引起脾胃 虛弱，中焦氣機(jī)升降失常，氣機(jī)痞塞，而見心下痞 悶; “脾宜升則健，胃宜降則和”，胃氣因虛上逆， 又兼噯氣、反胃、呃逆、反酸等癥。病機(jī)多屬于脾 胃虛弱，痰阻氣逆，升降失常，故顧護(hù)脾胃、調(diào)暢 氣機(jī)為其基本治則，常用旋覆代赭湯治療本病。我 們前期研究發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯能夠干預(yù) ＲE 的 發(fā)生發(fā)展，可修復(fù)鈣離子通道，引起胞內(nèi) Ca2 + 濃 度升高，提高食管平滑肌張力，但通過何種途徑仍 未明確。