目前，隨著臨床插管、心臟支架、人工關(guān)節(jié)等醫(yī) 療器材的廣泛使用，因此而帶來的細菌生物被膜感 染也越來越多。然而，生物被膜的抵抗作用使抗生 素難以殺死膜內(nèi)細菌，治療此類感染需要大劑量的 抗生素，從而極易導(dǎo)致細菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性，為臨 床治療帶來困難。最終，臨床治療時只能通過更換 留置物來徹底解決此類困惑，以至于給患者造成巨 大的身心創(chuàng)傷及高昂的醫(yī)療費用。為此，本研究以 表皮葡萄球菌生物被膜模型為研究對象，采用試管 二倍稀釋法，進行體外抑菌活性實驗，觀察大蒜素聯(lián) 用后在抑制生物被膜生長及其相關(guān)基因 icaA 表達 的變化，研究中藥的抑菌作用，探討降低臨床細菌耐 藥率的新途徑。

1 材料

1． 1 實驗菌株

由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī) 外科住院患者傷口分泌物中分離得來。

1． 2 主要試劑及儀器

大蒜素注射液( 江蘇正大 天晴) ; 鹽酸環(huán)丙沙星注射液( 廣東環(huán)球制藥) ; 營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基( 杭州天和) ; 普通細菌培養(yǎng)箱( 上海躍 進) 、全自動細菌鑒定和藥敏分析儀器 WalkAway － 96 ( SIEMENS，Germany ) 、二氧化碳細菌培養(yǎng)箱 ( SANYO，JAPAN) 、酶標儀( 北京普朗) 、QT － PCR 儀( ABI，美國) 、生物安全柜( 上海博迅醫(yī)療股份有限公司) 。

2 方法

2． 1 制備菌液制備

0． 5 麥氏度( 1． 5 × 108 CFU / mL) 的細菌菌液，再稀釋 15 倍，將濃度調(diào)為 1． 0 × 107 CFU /mL，于 4℃保存?zhèn)溆谩?br />
2． 2 試管二倍稀釋法

將抗菌藥進行梯度二倍稀 釋后接種檢測菌，37℃孵育 24h 后，將肉眼可見的細 菌生物被膜孔的最低藥物濃度定為藥物的最低抑菌 濃度。分五組進行: A 大蒜素組，準備 10 支無菌試 管，加入大蒜素，從濃度 900μg /mL 開始對倍稀釋， 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使終液濃度為 5 × 105 CFU /mL; B 環(huán)丙沙星組，準備 10 支無菌試 管，加環(huán)丙沙星，從濃度 100μg /mL 開始對倍稀釋， 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使終濃度約為 5 × 105 CFU /mL; C 大蒜素 + 環(huán)丙沙星組，取 10 支試 管，加入大蒜素，從濃度 900μg /mL 開始對倍稀釋， 后分別加 50μL 表皮葡萄球菌菌液，使終濃度為 5 × 105 CFU /mL，37℃培養(yǎng) 6h 后，加入環(huán)丙沙星，使 1 ～ 10 試管濃度為 100 ～ 0． 195μg /mL 10 個梯度; D 陰 性對照組只加肉湯; E 陽性對照組只加肉湯及菌液;37℃培養(yǎng) 24h 后，觀察記錄各組 MIC 值。

2． 3 藥物抑制細菌被膜的觀察

分 A 環(huán)丙沙星 組、B 大蒜素 + 環(huán)丙沙星組; 取 96 孔板，每孔總量 200μL，菌液終濃度 5 × 105 CFU /mL，37℃ 孵箱培養(yǎng) 24h 后，加入藥物組，其濃度按 1． 3． 2 所得的 MIC 進 行，繼續(xù)培養(yǎng) 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，取相 應(yīng)時間點實驗孔進行結(jié)晶紫染色，于 595nm 處測各 自 OD 值。

2． 4 藥物處理

QT － PCR 檢測基因 icaA、agr 的 表達 分 A 環(huán)丙沙星組、B 大蒜素 + 環(huán)丙沙星組; 每 孔總量 200μL，菌液終濃度 5 × 105 CFU /mL，37℃ 孵 箱培養(yǎng) 24h 后，加入藥物組，其濃度按" 1． 3． 2" 項下 所得的 MIC 進行，繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后超聲震蕩取菌， 利用 QT － PCR 檢測生物被膜相關(guān)基因 icaA 的表達 變化。

2． 5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用 SPSS 20． 0 統(tǒng)計軟件，將所得 數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資 料，用均數(shù)及標準差描述，根據(jù)設(shè)計類型采用相應(yīng)的 t 檢驗; 如不符合用四分位數(shù)和中位數(shù)描述，根據(jù)設(shè) 計類型采用相應(yīng)秩和檢驗，P ＜ 0． 05 有統(tǒng)計學意 義。

3 結(jié)果

單用抑制表皮葡萄球菌被膜時，MIC大蒜素 為( 28． 125 ± 3． 12) μg /mL，MIC環(huán)丙沙星 為( 3． 125 ± 0． 23) μg /mL; 兩者聯(lián)用時，MIC大蒜素、MIC環(huán)丙沙星 分別 為( 14． 063 ± 2． 30) μg /mL、( 1． 563 ± 0． 09) μg / mL，兩數(shù)據(jù)采用 t 檢驗分析后發(fā)現(xiàn)聯(lián)用前后 MIC 有 顯著差異( P ＜ 0． 05) ，且明顯降低。

在兩組藥物抑制 細菌被膜在 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h 時間點 結(jié)晶紫染色后，于 595nm 處測定 OD 值。兩組藥物抑制細菌被膜在 48h 后超聲震蕩取菌， 利用 QT － PCR 檢測生物被膜相關(guān)基因 icaA 的表達 量變化。

4 討論

當今，隨著臨床插管、心臟支架、人工關(guān)節(jié)等醫(yī) 療器械的廣泛使用，由此帶來的細菌生物被膜 ( bacterial biofilm，BBF) 的感染也越來越多。BBF 是指細菌附于惰性材料后，繁殖、分化，并分泌多糖 基質(zhì)將菌體包裹于其中克隆聚集纏繞形成的細菌聚 集體膜狀物，它通過產(chǎn)生細胞間脂多糖，保護細 菌不受抗菌藥物的抑制，從而逃避機體免疫，成為潛在感 染 源，最終引發(fā)感染的反復(fù)發(fā)作且難以控制。由此，BBF 的抵抗作用使抗菌藥物難以到 達膜內(nèi)殺死細菌，導(dǎo)致臨床治療需要大劑量抗生素， 從而容易引起細菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性，為治療帶 來嚴重的困難。最終，臨床上對此不得不更換留 置物來徹底解決此類問題，給患者帶來身心劇痛及 高昂的醫(yī)療費用。目前，表皮葡萄球菌是臨床常見 致病菌，也是引起 BBF 的常見細菌，表皮葡萄球 菌生物被膜形成而導(dǎo)致的各系統(tǒng)感染已成為臨床感 染難治性的重要類型之一。因此，探索新途徑治 療細菌生物被膜感染具有十分重要的臨床醫(yī)學意義。