眼的血 － 視網(wǎng)膜屏障( Blood － retinal barrier，BＲB) 包 括內(nèi)屏障和外屏障。內(nèi)屏障由血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連 接( 如粘連小帶和閉鎖小帶) 以及內(nèi)皮細(xì)胞中少量的囊泡 構(gòu)成; 外屏障由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞( Ｒetinal pigment epithelium，ＲPE) 之間的緊密連接和色素上皮調(diào)節(jié)媒介運(yùn)輸?shù)?不對(duì)稱分布的蛋白質(zhì)構(gòu)成。由于眾所周知的激光特性 與眼組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的相互作用，在醫(yī)療上，眼科是第一個(gè)應(yīng) 用激光作為治療手段的學(xué)科。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康有色家兔 30 只，體質(zhì)量 2． 0 ～ 2． 5 kg，雌雄不 限，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào): 醫(yī)動(dòng)字第 20 － 003 號(hào)。

1． 2 藥品及試劑

1． 2． 1 主要藥物

蠐螬酸性水解液制取方法: 蠐螬 400 g ( 湖南東潤(rùn)聯(lián)合醫(yī)藥有限公司中藥材部) ，清洗 10 遍以上， 浸泡 1 晚，后洗至無(wú)臭味。加蒸餾水 5 kg，加 37% HCl 至 pH 值為 2。高壓蒸汽鍋( 哈爾濱松花江醫(yī)療器械廠) 蒸 2 h。紗布( 4 ～ 5 層) 過(guò)濾，溶液中加 40% NaOH 至 pH 值為 6． 5 ～ 6． 8。冷卻，隔水加熱，濃縮至 1600 mL( 1 mL 溶液 = 0． 25 g 生藥) 。裝瓶，壓蓋，蒸汽高溫滅菌，冷藏保存。

1． 2． 2 主要試劑

P75NTＲ 一抗( 武漢博士德生物工程有 限公司) 、TrkA 一抗( 武漢博士德生物工程有限公司) 、DAB 顯色試劑盒( 武漢博士德生物工程有限公司) 。

1． 3 主要儀器及器械

眼科手術(shù)顯微鏡( 蘇州醫(yī)療器械有限公司) 、眼底接觸 鏡( 蘇州醫(yī)療器械有限公司) 、YZ/3 三面鏡( 蘇州醫(yī)療器械 有限公司) 、YZ5F 裂隙燈照相機(jī)( 蘇州醫(yī)療器械有限公 司) 、裂隙燈顯微鏡( 蘇州醫(yī)療器械有限公司) 、AG204 型電 子天平( 上海梅特勒—托利多儀器有限公司) 、TD5 － Ⅱ臺(tái) 式離心機(jī)( 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司) 、SSW 型電熱恒溫 水槽( 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司) 、721 分光光度計(jì)( 上海第三 儀器廠) 、LKB8800 超薄切片機(jī)( 瑞典 LKB 公司) 、多功能顯 微鏡( 西德 OPTON 公司) 、Olympus 光學(xué)顯微鏡( 日本日立 公司) 、石蠟包埋機(jī)( 日本日立公司) 、LeicaMPS30 照相系統(tǒng) ( 德國(guó) Leica 公司) 、Leica 石蠟切片機(jī)( 德國(guó) Leica 公司) 、萊特 532 眼底激光治療儀( 法國(guó)光太公司) 。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2． 1 激光損傷血 － 視網(wǎng)膜屏障動(dòng)物模型的建立

參照王曉英、陳少軍等造模方法并加以改進(jìn)。實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備: 激光照射當(dāng)日用復(fù)方托吡卡胺眼藥水滴眼 2 次。

2． 2 造模方法

兔稱重，固定，20% 烏拉坦 1 g /kg 耳緣靜脈注射全麻， 將兔頭部固定于激光機(jī)前，三面鏡置于結(jié)膜囊內(nèi)，以波長(zhǎng) 532 nm 的倍頻 Nd: YAG 激光( 光斑直徑 50 μm，能量 110 mw，曝光時(shí)間 0． 15 s) 在視盤及有髓神經(jīng)纖維下視網(wǎng)膜處 密集照射 40 個(gè)點(diǎn)，光斑緊鄰，最大間隔為 100 μm。光斑效 應(yīng)為 3 級(jí)( 中度 ～ 重度) : 中心白較濃或更濃，激光能量作用于內(nèi)核層。

2． 3 動(dòng)物分組及給藥方法

30 只成年健康有色家兔隨機(jī)抽取 10 只( 20 只眼) 作 為正常組，其余 240 只( 40 只眼) 造成激光損傷血 － 視網(wǎng)膜 屏障模型，并隨機(jī)分成模型組、蠐螬組，每組 10 只( 20 只 眼) 。 造模后第 2 天開(kāi)始給藥，正常組與模型組予 0． 9% 生 理鹽水灌胃，5 mL/kg，1 次/d; 蠐螬組予蠐螬提取液灌胃，5 mL/kg，均為 1 次/d( 相當(dāng)于成人等效最大劑量) 。

2． 4 標(biāo)本采集方法

連續(xù)灌胃 1 周后，各組隨機(jī)抽取 5 只兔進(jìn)行標(biāo)本的采 集和指標(biāo)的檢測(cè)，各組剩余的兔繼續(xù)同法灌胃至第 2 周結(jié) 束，再行標(biāo)本的采集和指標(biāo)的檢測(cè)。

2． 4． 1 眼球壁標(biāo)本的采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物耳緣靜脈注 射空氣處死，立即沿角膜緣作標(biāo)記后摘除眼球，生理鹽水沖 洗干凈，在冰生理鹽水中于角膜緣后 0． 5 mm 處剪開(kāi)眼球 壁，去除眼前節(jié)組織和玻璃體，在手術(shù)顯微鏡下找到激光斑 所處視網(wǎng)膜，大于激光斑范圍約 3 mm 切除該處眼球壁，用 4% 多聚甲醛在 4 ℃固定。

2． 4． 2 視網(wǎng)膜組織勻漿的采集制作

將依同法摘除的眼 球壁在手術(shù)顯微鏡下剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，用濾紙吸干 水分，電子天平稱其濕重，再用雙蒸水按照濕重∶ 體積 = 1 ∶ 19 配制成 5% 的視網(wǎng)膜勻漿液。

2． 5 觀測(cè)指標(biāo)及其方法

2． 5． 1 眼底觀察及照相

造模后即刻作眼底照相; 每日灌 胃前用直接檢眼鏡查看眼底，觀察眼底情況，光凝后 7 d、14 d 再次眼底照相。

2． 5． 2 光鏡下 HE 染色觀察

將已經(jīng) 4% 多聚甲醛固定 12 h 的眼球壁修片，切取激光斑部位視網(wǎng)膜( 正常組切取 相應(yīng)部位) ，再置于新的 4% 多聚甲醛固定液繼續(xù)固定，梯 度酒精脫水，石蠟包埋，切片，經(jīng)蘇木素伊紅染色( HE) ，封 片后鏡檢，顯微攝影。

2． 5． 3 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白( TrkA、p75NTＲ) 表達(dá)的免疫組化觀察

采用 S － P 免疫組化法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織的 TrkA、p75NTＲ 表達(dá): 石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇 脫水后切片，3% H2O2 去離子水孵育 5 ～ 10 min，阻斷內(nèi)源 性過(guò)氧化酶，根據(jù)需要對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理，滴加兔來(lái)源 的一抗，37 ℃ 孵育 1 ～ 2 h，PBS 沖洗，2 min × 3 次，滴加山羊抗兔 IgG 抗體 － HＲP 多聚體，37 ℃孵育 20 ～ 30 min，PBS 沖洗，2 min × 3 次，選用 DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗，選擇 適當(dāng)?shù)?封 片 劑 進(jìn) 行 封 片。陰 性 對(duì) 照 省 去 滴 加 TrkA、 p75NTＲ、一抗的步驟，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色。用 HAIPS － 1000 高清晰彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)計(jì)算面密度值( 目標(biāo)面 積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積) 作為半定量參數(shù)，測(cè)量 TrkA、p75NTＲ 的表 達(dá)。

2． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( 珋x ± s) 表示，用 SPSS 12． 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。先做方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者用單 因素方差分析及 LSD 多重比較。方差不齊者作 Tambane’ sT2 檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

造模后各組均有明顯激光斑，某些見(jiàn)出血灶，激光斑中 心顏色呈濃白色，周邊見(jiàn)淺色一圈光暈。7 d 后，蠐螬組激 光斑顏色變淡，中心見(jiàn)色素形成，且邊界清楚，可見(jiàn)少許玻 璃體混濁。14 d 后，蠐螬組激光斑部分轉(zhuǎn)化為瘢痕組織，范 圍較前明顯縮小。正常組: 視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu) 完整，層次清楚，細(xì)胞排列整齊。光感受器細(xì)胞內(nèi)外節(jié)無(wú)變 性，內(nèi)外核層細(xì)胞數(shù)目多，內(nèi)外網(wǎng)狀層無(wú)水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 數(shù)目多無(wú)空泡樣變性，細(xì)胞數(shù)目多。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為: 激光致血 － 視網(wǎng)膜屏障損傷主要是由于熱 灼陰津、熱灼血絡(luò)，氣津相關(guān)，氣能生津、化津、攝津，津能載 氣，若陰津虧耗，無(wú)以載氣，則氣失依附而氣散氣耗而致氣 虛; 氣生于精，精化為氣，陰精虧耗必致氣虛; 陰損耗氣而致 氣陰兩虛，氣為血帥，氣行血行，若氣虛運(yùn)血無(wú)力，可致氣虛 血瘀。最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的水腫、滲出、出血甚至壞死， 故治療常以益氣養(yǎng)陰、活血利水為原則。