球孢白僵菌 Beauveria bassiana 是一種可寄生在多種昆蟲上具較強致病性的真菌， 已被廣泛用作防 治森林、 農(nóng)作物蟲害的生物農(nóng)藥 ； 它產(chǎn)生大量如非核糖體多肽、 聚酮類等次生代謝產(chǎn)物， 可抑制多 種腐生或寄生線蟲 。 聚酮、 非核糖體多肽及其雜合化合物如聚酮中的紅霉素 、 四環(huán)素； 非核糖體 多肽中的青霉素、 頭孢霉素 ； 聚酮和非核糖體多肽的雜合化合物如他克莫司、 雷帕霉素 、 博來霉 素 、 埃博霉素等具有免疫抑制劑或抗腫瘤等生理活性。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

昆蟲致病真菌球孢白僵菌（菌株號： YH02）來源于云南云百草生物技術有限公司， 將 YH02 菌株接 種在 MY 固體培養(yǎng)基（malt/yeast extract medium）上， 置于 25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)， 每隔 2 周轉接 1 次； 用 于基因組 DNA 和總 RNA 提取的真菌接種于液體 MY 培養(yǎng)基中， 置于 120 r·min－1 和 25 ℃條件下培養(yǎng) 5~7 d 后， 收獲約 0.5 g 菌絲體， 用吸水紙徹底吸干后在液氮環(huán)境下用研缽研磨成粉末用于基因組 DNA 和 總 RNA 的提取。 MY 培養(yǎng)基的具體配方麥芽糖 6.0 g·L－1 ， 酵母提取物 4.0 g·L－1 ， 固體培養(yǎng)基配置時加 20.0 g·L－1 瓊脂。

1.2 試劑與器材

試驗涉及試劑包括： 真菌基因組 DNA 提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）， 高保真聚合 酶、 真菌總 RNA 提取試劑盒（大連寶生物工程公司）， 反轉錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）， 無縫 克隆試劑盒（Biomiga）。 主要使用儀器為 NanoDropTM 2000 紫外分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）、 Azure C300 凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems）、 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、 多功能組合搖床（江蘇太倉實驗設備廠）。

1.3 Bbpks2 基因的挖掘及克隆

首先以曲霉中已報道過的 PKS 基因為模板， 利用本地 BLAST（basic local alignment search tool）對球 孢白僵菌基因組進行掃描， 獲得可能含有 PKS 基因的重疊群（contigs）， 然后利用 antiSMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org/）軟件進行驗證， 并利用 GENEFISH 對重疊群進行開放閱讀框掃描， 通過 生物信息學分析獲得白僵菌基因組中 Bbpks2 基因的 DNA 序列。 根據(jù) DNA 序列設計 2 對特異引物（Bbpks25F： 5′-ATGTCTTCGCACCAAAACGA-3′； Bbpks2MR： 5′- AACAGCACTGTCACTGTCCAC-3′ ； Bbpks2MF： 5′ -AACGCTGGCTATAATGCTCTT-3′ ； Bbpks23R： 5′ - GGCTTCCTGGAGCGGTAA-3′）用于 Bbpks2 基因全長 cDNA 的克隆。 以球孢白僵菌的 cDNA 為模板， 用 HiFi 高保真酶分別擴增出 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段， 經(jīng) DNA 純化試劑盒將這 2 個片段純化后， 按照無縫克隆試劑盒說明書中的具體步驟將 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段連接起來， 獲取全長 cDNA。 將該基因片段連接到克隆載體 Peasy-T3 上， 轉化到 Trans-T1 感受態(tài)細胞中， 進行藍白斑篩選后， 通過 菌落 PCR 篩選含有插入片段的陽性克隆送到上海生工進行測序。

1.4 聚類分析方法

從美國生物技術信息中心（NCBI）上選擇功能已知且鑒定過化合物的 PKS/NRPS 蛋白序列， 包括黃曲 霉 Aspergillus flavus， 米曲霉 A. oryzae 中編碼環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid）生物合成的 CpaA 基因 （BAI43678， BAG82673）， 擴展青霉 Penicillium expansum 中編碼球毛殼甲素（chetoglobosin A）生物合成 的 CheA 基因（CAO91861）， 棒曲霉 A. clavatus 中編碼細胞松弛素 E（cytochalasin E）生物合成的 CcsA 基 因 XM_001270542， 異孢鐮刀菌 Fusarium heterosporum 中編碼伊快霉素（equisetin）的 EqiS 基因（Q5SBL2）， 水稻惡苗病菌 Fusarium fujikuroi， 串珠赤霉菌 Gibberella moniliformis 及假禾谷鐮孢菌 Fusarium pseudograminearum 等 真菌 中 編 碼鐮 刀 菌素 C（fusarin C）生物 合成的 FusA（AFP73394） ， FusS （AAT28740） ， pks10（EKJ71911）等基因， 煙曲霉 Aspergillus fumigatus 中編碼假散囊菌素 A（pseurotin A）的 PsoA 基因 （ABS87601）， 球孢白僵菌中編碼卵孢白僵菌素（tenellin）的 TenS 基因（XP_008600657）等蛋白序列用于聚 類分析， 采用 MEGA 7.0 中的 Clustal W 程序對所選擇的 PKS 蛋白序列和球孢白僵菌中的 BbPKS1 蛋白 序列進行比對后， 采用鄰位相接法（neighbor-joining）， 自檢舉 1 000 次， 其余采用默認參數(shù)構建系統(tǒng)進 化樹。 依據(jù)聚類結果， 從基因起源與功能分化的角度預測該基因功能， 并進一步推測該基因產(chǎn)生的聚酮 化合物。

1.5 Bbpks2 基因在不同培養(yǎng)基上的表達

根據(jù)分離得到的 Bbpks2 基因的 DNA 序列， 設計特異檢測引物（TBbpks2F： TCTCCTTGGCAAGGTTACTG； TBbpks2R： ACCACGCTCCATCATGTACT）。 然后將球孢白僵菌培養(yǎng)在添加不同碳源、 氮源的培 養(yǎng)基上。 不同碳源實驗的基礎培養(yǎng)基為 6.0 g·L－1 麥芽浸粉， 3.0 g·L－1 酵母提取物， 分別添加 4.0 g·L－1 乳 糖、 甘露醇、 麥芽糖、 葡萄糖、 山梨醇、 果糖、 肌醇； 不同氮源實驗的基礎培養(yǎng)基為 1.8 g·L－1 麥芽糖， 6.0 g·L－1 葡萄糖， 分別添加 4.0 g·L－1 牛肉浸粉、 酪蛋白胨、 胰蛋白胨、 馬鈴薯。 培養(yǎng) 14 d 后， 從每種 培養(yǎng)基上收獲 0.5 g 菌絲體， 采用真菌總 RNA 提取試劑盒按照說明書步驟提取各自的總RNA， 并選擇濃 度合適的 RNA 采用反轉錄試劑盒將其反轉錄成 cDNA， 再用特異引物 TBbpks2F 和TBbpks2R 檢測該基 因的表達情況。 在瓊脂糖凝膠電泳檢測過程中， 各 PCR 產(chǎn)物和 1 kb DNA marker 的點樣量均為 2.5 μL， 電泳結束后， 利用 Azure C300 凝膠成像系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件分析各條帶的積分光密度， 比較各 PCR 產(chǎn)物條 帶的積分光密度值， 并以該值與 1 kb marker 的條帶進行比較作為相對表達量繪制柱狀圖。

2 結果與分析

經(jīng)無縫克隆獲得 Bbpks2 基因的全長 cDNA。 分析顯示： Bbpks2 基因全長 12 051 bp， 編碼 4 016 個 氨基酸； 經(jīng)過序列相似性及保守結構域的分析顯示， 該基因編碼蛋白的結構域組織順序為 KS-AT-DHMT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； 該蛋白同時含有 PKS 和 NRPS 酶蛋白的結構域， 由此推斷該蛋白是一種 PKS/ NRPS 酶蛋白復合體。該聚類樹可 分為 4 個較大的亞類（分支Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ）， 各個亞類間的結構域組織順序存在差異， 至少存在 1 個結 構域的不同； 鐮刀菌屬 Fusarium 真菌中編碼伊快霉素、 不同真菌中參與編碼細胞松弛素 E 的酶蛋白聚 到同一分支上， 且二者親緣關系明顯較近。 球孢白僵菌的 BbPKS2 蛋白與這 2 類酶蛋白被歸類到分支Ⅱ 中， 該亞類的結構域組織順序為 KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； BbPKS2 與球孢白僵菌 JEF007 菌 株（PMB64475.1）、 頭狀蟲草 Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）聚在一個亞分支中； 推測 BbPKS2 蛋 白所參與合成的天然次生代謝產(chǎn)物與伊快霉素、 細胞松弛素 E 存在一定的結構相似性。

3 討論

球孢白僵菌主要是在機械壓力和酶共同作用下侵染昆蟲寄主 ， 在昆蟲體內通過次生代謝途徑中相 關酶類所產(chǎn)生的毒素致死寄主 。 但該真菌次生代謝途徑中所產(chǎn)生的毒素除少數(shù)外， 尚有大量的次生代 謝產(chǎn)物生物合成基因未與相關化合物關聯(lián)。 結合基因組挖掘技術和一菌多產(chǎn)物策略（one strain many compounds， OSMAC）、 異源表達等操作技術可促進該問題的解決， 從真菌基因組數(shù)據(jù)中可大量挖掘得 到 PKS， NRPS 等生物合成基因， 通過序列相似性、 結構域、 基因片段的大小及聚類分析等初步推斷該 基因的功能， 初步了解該酶所參與合成化合物的某些結構 。 如編碼 2-吡啶酮卵孢白僵菌素（2-pyridone tenellin）酶蛋白的 PKS/NRPS 基因約 12.9 kb ， 編碼鐮刀菌素 C 酶蛋白的 fusA 基因（PKS/NRPS）約 11.9 kb ； BALI 等 在大腸埃希菌 Escherichia coli 中過量表達其 SDR 等末端釋放結構域， 發(fā)現(xiàn)該結構 域對結構中含有環(huán)己酮的底物具較高活性。 同時因本研究中的 Bbpks2 基因尚未發(fā)現(xiàn)有較高同源性基因 存在， 通過結構域分析推測該基因所編碼的酶蛋白屬于 PKS/NRPS， 參與聚酮/非核糖體多肽的生物合 成， 且該化合物與伊快霉素、 細胞松弛素 E 存在某些共同的結構； 通過比較分析伊快霉素、 細胞松弛素 E， 綜合分析該化合物可能含吡咯烷酮結構。



 

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