咸鰳魚是浙東地區(qū)的傳統(tǒng)腌魚制品，因其肉質(zhì)鮮 美且具獨(dú)特的“霉”香味而備受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?。其?工是以新鮮鰳魚為原料，不去除魚鱗、魚鰓及內(nèi)臟，經(jīng) 3 次加鹽腌制而成，加鹽量通常在 30 %~50 %。腌魚生 產(chǎn)過程實(shí)質(zhì)上是一個(gè)復(fù)雜微生態(tài)體系在人為控制鹽 度、發(fā)酵溫度、濕度條件下，使微生物群落結(jié)構(gòu)及功能 趨于人們期望的方向演化的過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鰳魚：購于舟山、寧波、杭州蕭山水產(chǎn)品批發(fā)市 場，各采集 2 種樣品，依次編號為 A（腌制 90 d，25 ℃開 放腌制）、B（-18 ℃凍藏）、C（室溫 22 ℃攤放）、D（室溫 22 ℃攤放）、E（室溫 22 ℃攤放）、F（室溫 22 ℃攤放）。除 舟山市場采集的 A 樣品為商販自制咸鰳魚外，其余產(chǎn) 品均為東南亞進(jìn)口咸鰳魚。 2216E 培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA 提取試劑盒：北京莊盟生物科技有限公司；E.Z.N.A. R Stool DNA Kit、Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker：TaKaRa 寶成試劑有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺 SW-CJ-1CU、蒸汽壓力滅菌鍋 YXQSG46-280SA：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；高速冷凍離心 機(jī) 5810R：英國艾本德公司；超微量分光光度計(jì) MN913、高速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）儀 A24811：美國賽默飛世爾公司；凝膠電泳系統(tǒng) Tanon EPS600、凝膠成像系統(tǒng) Tanon 4200：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

采集鰳魚鰓后部、背部及腹部肉，剪碎混勻。同種 樣品挑選體態(tài)大小一致、個(gè)體完整的 3 尾魚，將其魚肉 混勻，稱取 25 g 魚肉樣品至含 225 mL 生理鹽水的錐 形瓶中，震蕩混勻后制備梯度稀釋液，并涂布于 2216E 培養(yǎng)基。選擇適宜的稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并隨機(jī)挑 取 40 個(gè)菌落，純化 2 次~3 次后，接種于相應(yīng)的液體培 養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng) 24 h~48 h，制備 30 %的甘油菌液， -80 ℃凍藏備用。取 2216E 肉湯活化好的菌液 2 mL，按照試劑盒說 明書操作，提取菌株基因組 DNA。參考袁開等方法， 對分離菌株 16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序 工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列 于 GenBank 中進(jìn)行 BLAST 比對分析，部分序列結(jié)果提 交至 NCBI Genebank 數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

采用 2216E 培養(yǎng)基對各樣品中可培養(yǎng)微生物進(jìn) 行了計(jì)數(shù)與分離，咸鰳魚樣品在 2216E 培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量集中分布于 4.9 log CFU/100 g~5.2 log CFU/100 g。 每組樣品隨機(jī)挑取 40 個(gè)菌落，經(jīng)兩次純化后，從 A、C、 D、E、F 組樣品中共分離到 151 株可培養(yǎng)菌 （B 組樣品 微生物傳代后均未生長）。分離菌株經(jīng)過提取基因組、 擴(kuò)增獲得 16S rDNA 序列，測序結(jié)果經(jīng)與美國國立生 物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology In－ formation，NCBI）數(shù)據(jù)庫比對分析，將其鑒定至種、屬 水平，具體結(jié)果見表 3。將部分序列提交至 Genebank 數(shù)據(jù)庫，獲取序列編號為 MK205156~MK205178。芽孢桿菌屬是一類廣泛分布在土壤和水圈中的 細(xì)菌，在海洋環(huán)境中有大量分布。市售咸鰳魚中的芽 孢桿菌屬細(xì)菌，可能來源于鰳魚自身的生存環(huán)境，也 可能在加工或保藏中混入。通常情況下，添加米飯等 淀粉質(zhì)原料的發(fā)酵魚制品生產(chǎn)中，芽孢桿菌屬細(xì)菌會(huì) 成為優(yōu)勢菌，并且具有較為豐富的多樣性。在高鹽 腌制海產(chǎn)品中，枯草芽孢桿菌僅可能少量存在于產(chǎn)品 中。A、D、E、F 組樣品中，枯草芽孢桿菌數(shù)量占據(jù)絕對 優(yōu)勢。咸鰳魚加工原料中未加入淀粉質(zhì)原料，且加鹽 量達(dá)魚體重的 30 %~50 %，因此，大量的芽孢桿菌可能 來源于生產(chǎn)后的貯藏或運(yùn)輸中。

3 討論

基于分離培養(yǎng)研究技術(shù)從市售咸鰳魚中獲得 151 株可培養(yǎng)微生物，16S rDNA 序列分析顯示，分離菌株 可歸至 14 個(gè)屬和 23 個(gè)種。芽孢桿菌屬細(xì)菌是 A、D、 E、F 組樣品中優(yōu)勢微生物；C 組樣品中葡萄球菌為優(yōu) 勢菌，嗜冷桿菌和芽孢桿菌數(shù)量次之。上述 3 個(gè)屬以 外的其他種屬細(xì)菌在各類樣品中均呈零星分布的狀 態(tài)。然而，免培養(yǎng)高通量測序結(jié)果在屬水平上反映出 的微生物種類與分離培養(yǎng)方法不盡相同。Illumina MiSeq 測序結(jié)果顯示，C、D、E、F 組 中 狹 義 梭 菌 屬 （Clostridium sensu stricto）和分類梭菌科（Clostridiaceae unclassified）微生物數(shù)量最多是其中的主要優(yōu)勢菌，而 A 組樣品中堿桿菌屬 （Alkalibacillus）、嗜鹽古生菌 （Natrinema） 幾乎占據(jù)了主導(dǎo)地位，B 組樣品則以慢性 芽孢桿菌屬（Lentibacilus）為主。



 

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