糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病微血管并發(fā)癥的主要并發(fā)癥之一，并且是導(dǎo)致終末期腎病( end stage renal disease，ESＲD) 的主要原 因。DN 的主要病理變化包括腎小球肥大、腎小 球基底 膜 增 厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚以及腎纖維化等。腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化( epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是導(dǎo)致腎纖維化的 重要機(jī) 制 之 一。

1 材料

1． 1 儀器

上海博迅HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 ; 酶標(biāo)儀( 美國 BioTek 公司) ; 高速冷 凍離心機(jī)( 美國 Sigma 公司) ; 倒置顯微鏡( 日本 Olympus 公司) ; 超凈工作臺(tái)( 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣 技術(shù)有限公司) ; 脫色搖床( 海門市麒麟醫(yī)用儀器 廠) ; Western 電泳-轉(zhuǎn)印電源( 美國 Bio-Ｒad 公司) ; 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)( 美國 Bio-Ｒad 公司) ; 雙紅外激光成 像系統(tǒng)( Odyssey 公司) 。

1． 2 試藥

大黃素( 徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室 提取) ，純度檢測(cè)見結(jié)果“3． 1”。DMEM 培養(yǎng)基( 美 國 Invitrogen Gibco 公司，ＲEF31600-034) ; 雷帕霉素 ( 美國 CST 公司，貨號(hào): 9904s) ; p-mTOＲ( Ser2448) 抗 體( 美國 CST 公司，貨號(hào): 5536) ; p-P70S6K 抗體( 美 國 CST 公司，貨號(hào): 9234) ; 兔抗 α-SMA 單克隆抗體 ( 貨號(hào): 1184-1) ; 兔抗 E-Cadherin 單克隆抗體( 貨 號(hào): 5409-1) ( Abcam 公司) ; β-actin 抗體( 美國 Biworld 公司，貨號(hào): AP0060) ; 胎牛血清( 依克賽公司， 批號(hào) FSPl00) ; 熒光二抗( 奧德賽公司，批號(hào) C40721- 02) ; 抗熒光猝滅封片液( 編號(hào): P0126) 、PMSF( 編 號(hào): ST506) ( 碧云天生物技術(shù)研究所) 。青霉素-鏈 霉素溶液( 100 × ，編號(hào): C0222) 、BCA 蛋白濃度測(cè)定 試劑盒( 編號(hào): P0010) 、Western 一抗稀釋液( 編號(hào): P0023A) 、Western 二抗稀釋液( 編號(hào): P0023D) 、ＲAPI 裂解液( 編號(hào): P0013B) 均購自于碧云天生物技術(shù) 研究所。

1． 3 藥液配制

精密稱取雷帕霉素 18． 28 mg，溶 解于 1 mL DMSO 中，配制成濃度為 20 mmol·L － 1 的 母液分裝，稀釋為 20 μmol·L － 1 的二級(jí)母液保存。 給藥時(shí)每 1 mL 培養(yǎng)基加入 1 μL 濃度為 20 μmol· L － 1 的雷帕霉素，使得培養(yǎng)液雷帕霉素的終濃度為 20 nmol·L － 1 。大黃素用 DMSO 配成 50 mmol·L － 1 母液，-20 ℃保存。臨用前用 DMEM 高糖稀釋成 1， 2． 5，5，10，20，40，80，160 μmol·L － 1 。

1． 4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人近端腎小管上皮細(xì)胞( HK-2) ， 購自上海復(fù)祥生物科技有限公司( 來源于 ATCC， CＲL-2190) ，購入后接種于含 10% 新生牛血清、1 × 105 U·L － 1 青霉素、100 mg·L － 1 鏈霉素、3． 7 mg·L － 1 碳酸氫鈉的 DMEM 培養(yǎng)液中，于 37 ℃、5% 二氧化 碳，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2 ～ 3 d 傳代 1 次。

2 方法

HK-2 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種，同 步化 12 h 后，分為正常組( NG 組，5． 56 mmol·L － 1 葡 萄糖) 、甘露醇組( MA 組，5． 56 mmol·L － 1 葡萄糖 + 54． 44 mmol·L － 1 甘露醇) 、高糖組( HG 組，60 mmol· L － 1 葡萄 糖) 、溶 劑 組 ( 5． 56 mmol·L － 1 葡 萄 糖 + 0． 1% DMSO) 、大黃素組( EMO 組，60 mmol·L － 1 葡萄 糖 + 10 μmol·L － 1 大黃素) 和 mTOＲ 抑制劑組( Ｒapamycin 組，60 mmol·L － 1 葡萄糖 + 20 nmol·L － 1 雷帕霉 素) 。用 DMEM 培養(yǎng) 基制成 4 × 107 /L 細(xì)胞懸液，接種于 96 孔培養(yǎng)板，培 養(yǎng) 24 h 棄上清，加人無血清正常 DMEM 培養(yǎng)基，同 步化 12 h 后，在正常 DMEM 的基礎(chǔ)上給予不同濃度 的大黃素，培養(yǎng) 72 h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL， 于 37 ℃、5% 二氧化碳，培養(yǎng)箱中孵育 4 h 后，用酶 標(biāo)儀在波長 490 nm 處測(cè)定各孔光密度值( D) ，實(shí)驗(yàn) 重復(fù) 3 次。HK-2 細(xì)胞按各處理因素處理 72 h 后，冰上裂解、提 取細(xì)胞總蛋白，采用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白 濃度。取 55 μg 蛋白上樣量，經(jīng) 8% 的 SDS-PAGE 電泳，用電轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 NC 膜，室溫 封閉 1 h，加抗 p-mTOＲ、p-P70S6K、p-4-EBP1、E-cadherin、α-SMA 抗體( 1 1 000) ，4 ℃ 過夜，PBST ( 5 min /3 次) ，充分洗滌后，孵熒光二抗( 11 000) ，室 溫 1 h，Odyssey 儀器拍照，Image J 軟件分析條帶灰 度值。應(yīng)用 SPSS 17． 0 統(tǒng)計(jì)軟件處理， x ± s 表示，2 組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用 單因素方差分析( one-way ANOVA) ，若數(shù)據(jù)不符合 方差齊性，則采用 Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。P ＜ 0． 05 表 示差異有顯著性。

3 結(jié)果

色譜柱: Agilent ZOＲBAX SB-C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ; 流 動(dòng)相: methanol-water ( 7525，phosphoric acid adjusted pH 2． 8 ) ; 檢 測(cè) 波 長: 225 nm; 流 速: 1． 0 mL· min － 1 ; 柱溫: 35 ℃甘露醇組與正常組比較差異無顯 著性( P ＞ 0． 05) ; 溶劑組與正常組比較差異無顯 著性( P ＞ 0． 05) ; 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 EMO 與 正常組比較差異無顯著性 ( P ＞ 0． 05 ) ; 20，40， 80，160 μmol·L － 1 EMO 與正常組比較差異有顯著性( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，提示大黃素濃度為 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 對(duì)正常培養(yǎng)的細(xì)胞毒性很 小?？紤]到大黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管 EMT 的 抑制作用，故選擇對(duì)正常細(xì)胞生長無影響的 10 μmol·L － 1 作為干預(yù)濃度。正常培養(yǎng)的 HK-2 細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鵝卵石鋪路 樣分布，高糖培養(yǎng)的 HK-2 細(xì)胞形態(tài)從正常的圓形 或橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形的纖維化樣形態(tài)，給予大黃 素培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變回橢圓形，給予雷帕霉 素后細(xì)胞同樣由長梭形變成橢圓形或鵝卵石鋪 路樣。

4 討論

DN 是糖尿病較為常見的并發(fā)癥，其病理變化 呈慢性進(jìn)行性進(jìn)展，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭和患者 死亡。DN 晚期常表現(xiàn)為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維 化，其中腎小管 EMT 是腎間質(zhì)纖維化的重要原因之 一。Iwano 等實(shí)驗(yàn)證明，腎間質(zhì)纖維化的間充 質(zhì)細(xì)胞，36% 來源于腎小管上皮細(xì)胞，說明 EMT 是 間質(zhì)成纖維細(xì)胞的主要來源，也是腎間質(zhì)纖維化的 中心環(huán)節(jié)。mTOＲC1 的異常激活參與了糖尿病狀態(tài) 下多個(gè)病理進(jìn)程包括 DN，以及腎纖維化等。



 

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