抗生素的發(fā)現(xiàn)為人類(lèi)對(duì)抗感染性疾病做出了巨 大的貢獻(xiàn)。但是近些年來(lái)隨著人們對(duì)抗生素的不 合理使用 甚 至 濫 用，直接導(dǎo)致大量耐藥菌的產(chǎn)生， 常規(guī)的抗菌藥物對(duì)于治療常見(jiàn)的細(xì)菌感染也愈發(fā)困難。蛇毒是從毒蛇腺體中分泌的一種液體，主要 成分為一些活性酶類(lèi)、多肽及蛋白質(zhì)，占毒液干重 ９０％～９５％，還含有部分脂肪、碳 水 化 合 物、金 屬 離子、核 苷、胺類(lèi)以及游離氨基酸等。

１ 材料與方法

１．１ 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

１．１．１ 實(shí)驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ－ ｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ＣＭＣＣ２６００３）、甲型溶血性鏈球菌 ［α－ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＣＭＣＣ （Ｂ）３２２１３］、 枯 草芽胞 桿 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，ＣＭＣＣ６３５０１） 和 大腸埃希菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＣＭＣ４４１１３），以上 菌株均由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供 （購(gòu)自 中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

１．１．２ 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

廣西眼鏡蛇和五步蛇蛇毒 由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供，銀環(huán)蛇蛇毒購(gòu)自 義烏市蛇毒研究所，ＭＨ 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、ＭＨ 肉湯培養(yǎng) 基粉由北京索萊寶科技有限公司提供，胎牛血清由 美國(guó) ＧＩＢＣＯ 公司提供。

１．１．３ 實(shí)驗(yàn)儀器

ＺＨＷＹ－１１１Ｂ型恒溫培養(yǎng)振蕩器 （上海智城分 析 儀 器 制 造 有 限 公 司），ＭＰＪ１５０型 霉 菌培養(yǎng) 箱 （上 海 科 恒 實(shí) 業(yè) 發(fā) 展 有 限 公 司），YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 （上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），ＭｉｃｒｏＣＬ１７Ｒ 型 高 速 低 溫 離 心 機(jī) （德 國(guó) ＴＨＥＲＭＯＩＥＣ公 司），ＣＸ３１＋ＤＰ７３型 倒 置 顯 微 鏡（奧林巴斯有限公司），ＴＶ－１９０１型紫外可見(jiàn)分光光 度計(jì) （北京普析通用儀器有限公司），ＤＫ－９１４型恒 溫水浴鍋 （上海森信儀器有限公司）。

１．２ 實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１ 細(xì)菌培養(yǎng)

分別將甘油凍存的金黃色葡萄球 菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿 菌室溫 融 化 后，劃 線(xiàn) 接 種 至 ＭＨ 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 平 板， ３７ ℃培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng)１８～２４ｈ，挑 取 典 型 菌 落 接 種 至 ＭＨ 肉湯培養(yǎng)基，３７ ℃恒溫振搖箱孵育１６～１８ｈ， 轉(zhuǎn)速２００ｒ／ｍｉｎ。

１．２．２ 細(xì)菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及菌懸液制備

將 孵育好的細(xì)菌室溫下１０００ｒ／ｍｉｎ （離心半徑４．３ｃｍ） 離心４５ｓ收集菌液，重復(fù)用無(wú)菌生理鹽水洗脫２次， 按倍數(shù)稀釋法用無(wú)菌生理鹽水依次稀釋原菌液作為 實(shí)驗(yàn)組，其對(duì)應(yīng)的無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照，利 用紫外分光光 度 計(jì) 測(cè) 定 細(xì) 菌 在６００ｎｍ 時(shí) 的 吸 光 度 （Ａ）值，以Ａ 值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，分 別繪制４種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。確定 所用原菌液濃度為１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ 的 Ａ 值，然后 １∶１００用 ＭＨ 液體培養(yǎng)基稀釋至 １×１０６ ＣＦＵ／ｍＬ 備用。

１．２．３ 蛇毒儲(chǔ)存液配制

?。撤N蛇毒分別溶于無(wú)菌 生理鹽水中，濃度不低于初始實(shí)驗(yàn)濃度的１０倍，經(jīng) ０．２２μｍ 無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌，于－２０ ℃冷凍保 存?zhèn)溆谩?br />
１．２．４ ＭＩＣ測(cè)定

分別制備３種蛇毒的 ＭＩＣ 測(cè)定 板，首先在９６孔板所有的 Ｖ孔內(nèi)依次加入 ＭＨ 肉湯 培養(yǎng)基各１００μＬ。其次，各在 Ｂ／Ｃ／Ｄ 三排的第１個(gè) Ｖ 孔內(nèi)加配好的蛇毒１００μＬ，使第１個(gè)孔內(nèi)的初始 濃度為１２８０μｇ／ｍＬ，混勻后依次對(duì)藥物進(jìn)行二倍 稀釋?zhuān)吹冢眰€(gè)孔中加入藥液后用移液槍充分吹打 使藥物 與 肉 湯 充 分 混 勻，然 后 吸 取 １００μＬ 加 入 第２個(gè)孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照 此 重 復(fù)至最后一孔，混勻后從第１２列吸出１００μＬ棄掉。 最后，再在 Ｂ／Ｃ／Ｄ三排的每一孔中加入稀釋好的菌 液１０μＬ，使每個(gè)孔內(nèi)菌液濃度為１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 在 Ａ 排上做一排陰性對(duì)照 （只 加 ＭＨ 肉 湯 不 加 菌 液）和在 Ｈ 排上做一排陽(yáng)性對(duì)照 （只加菌液不加藥 液），詳 見(jiàn) 表 １。將 ９６ 孔 板 放 入 ３７ ℃ 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 （內(nèi)置濕盤(pán)保持濕度）培養(yǎng)。

１．２．５ ＭＩＣ值 結(jié) 果

讀 取 分別觀測(cè)讀取培養(yǎng) ２４、 ４８和７２ｈ后的 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００結(jié)果，當(dāng)陽(yáng) 性對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌明 顯生長(zhǎng)時(shí)， 采用目測(cè)法讀取 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００數(shù)值。以肉眼能觀察到在小 孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度 為 ＭＩＣ１００； 以肉眼能觀察到在小孔內(nèi)抑制８０％細(xì)菌生長(zhǎng)的最低 藥物濃度為 ＭＩＣ８０；以肉眼能觀察到在小孔內(nèi)抑制 ５０％細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為 ＭＩＣ５０。

２ 結(jié) 果

對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞 桿菌，廣西眼鏡蛇蛇毒的抑菌作用最強(qiáng)，五步蛇蛇 毒的抑菌作用次之，銀環(huán)蛇蛇毒最弱；對(duì)于甲型溶 血性鏈球菌，五步蛇蛇毒的抑菌作用強(qiáng)于廣西眼鏡 蛇和銀環(huán)蛇。對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、甲 型溶血性鏈球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌、枯草芽 胞桿菌，廣西眼鏡蛇蛇毒對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的 ＭＩＣ值均高于其對(duì)革蘭陰性菌的 ＭＩＣ值２倍或２倍以上，提 示革蘭陽(yáng)性菌對(duì)廣西眼鏡蛇蛇毒敏感度低于革蘭陰 性菌的。

３ 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣西眼鏡蛇蛇毒對(duì)金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希 菌和枯草芽胞桿菌均有不同程度的抑制作用，且作 用較為明顯，推測(cè)其主要原因可能為：細(xì)胞毒素是 眼鏡蛇蛇毒的主要活性成分，約占蛇毒總蛋白質(zhì)含 量的４０％，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒素與細(xì) 菌的細(xì)胞膜結(jié)合后，通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，造 成細(xì)胞膜破損，產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi) 容物外 滲，進(jìn) 而 使 細(xì) 菌 死 亡。與 革 蘭 陰 性 菌相比革蘭陽(yáng)性菌有較厚的肽聚糖，且革蘭陽(yáng)性菌的 細(xì)胞壁比較厚，這可能是廣西眼鏡蛇蛇毒對(duì)革蘭陽(yáng) 性菌的抑菌效果比革蘭陰性菌差的原因之一。實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)表明五步蛇蛇毒也具有一定的抗菌作用，可能 與五步蛇蛇毒中也含有少量細(xì)胞毒素有關(guān)，五步 蛇蛇毒對(duì)甲型溶血性鏈球菌的抑制作用比較強(qiáng)，原 因有待進(jìn)一步研究。銀環(huán)蛇蛇毒無(wú)明顯抑菌作用可 能與其蛇毒成分中以神經(jīng)毒素為主有關(guān)，神經(jīng)毒素 毒性較強(qiáng)，可有神經(jīng)肌肉阻斷作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致 外周呼吸麻痹引起死亡，但小劑量的神經(jīng)毒素可 能仍不足以對(duì)細(xì)菌有抑制作用。