活性污泥法廣泛應(yīng)用于城市污水處理廠，污 泥是污水處理廠在污水凈化過(guò)程中產(chǎn)生的含水率不 同的半固態(tài)或固態(tài)物質(zhì)，按泥含水率 80%計(jì)，每萬(wàn) 立方米污水經(jīng)處理后產(chǎn)生的污泥量為 5~10t，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，污泥處置費(fèi)用約占污水處理廠投資和運(yùn)行費(fèi) 用的 20%~50%。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本文作者實(shí)驗(yàn)室從廢水中分離并保存的解淀粉 芽孢桿菌，命名為 DM1。

1.2 主要儀器和試劑

麥芽糊精，山東西王糖業(yè)有限公司；玉米淀粉， 食品級(jí)，山東恒仁工貿(mào)有限公司；脫脂奶粉，內(nèi)蒙 古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；可溶性淀粉、胰蛋 白胨、瓊脂粉、酵母浸膏、牛肉浸膏等，生化試劑 BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、無(wú)水乙 醇、丁二酸鈉等，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司；酵母浸粉等，生物試劑，北京奧博星生物技 術(shù)有限責(zé)任公司。 ZQZY-AF8 組合式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚 儀器有限公司；HQ40d pH 計(jì)，瑞士梅特勒公司； YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè) 有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH-300DE 型數(shù)控超聲清洗 器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；博迅SPX-150B-Z 型 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； SW-CJ-2FD 潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公 司；WGLL-230BE 電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司。小型噴霧干燥機(jī)，上海鑫翁科學(xué)儀 器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

菌株斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng) 基均為 LB 培養(yǎng)基。 LB 培養(yǎng)基組成為：10g/L 胰蛋白胨、5g/L 酵母 粉、5g/L NaCl，調(diào)節(jié) pH 為 7.2，120℃高壓蒸汽滅 菌 20min。固體 LB 培養(yǎng)基，瓊脂含量為 20g/L。

1.4 菌株

DM1 培養(yǎng)方法 菌種活化方法：將保藏的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng) 基，30℃活化 24h。 種子液培養(yǎng)方法：用接種環(huán)挑取 1 環(huán)菌泥，接 入裝有 10mL LB 培養(yǎng)基的 50mL 的搖瓶中，30℃活 化 22h。 菌株培養(yǎng)方法：采用裝有 100mL 種子培養(yǎng)液的 250mL 搖瓶培養(yǎng)，接種量 2%，于 30℃、200r/min 培養(yǎng) 48h，獲得發(fā)酵液。

1.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1 碳源種類(lèi)

在 LB 培養(yǎng)基和 30℃、200r/min 培養(yǎng)條件下， 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中原有成分不變的前提下，分別添加濃 度均為 10g/L 的乙酸鈉、玉米淀粉、可溶性淀粉、葡 萄糖、丁二酸鈉，選擇最優(yōu)碳源。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.5.2 碳源濃度的選擇

在 LB 培養(yǎng)基和 30℃、200r/min 培養(yǎng)條件下， 上述篩選得到的最佳碳源，考察其濃度（5g/L、 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L）對(duì)菌株液體 發(fā)酵活菌數(shù)的影響。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.5.3 氮源種類(lèi)

在 LB 培養(yǎng)基和 30℃、200r/min 培養(yǎng)條件下， 以可溶性淀粉為碳源，分別添加 10g/L 的硫酸銨、 尿素作為單一氮源及體積比為 1︰1、1︰2、1︰3 的胰蛋白胨和酵母粉作為混合氮源加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中，篩選最優(yōu)氮源。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.5.4 氮源濃度的選擇

在 LB 培養(yǎng)基和 30℃、200r/min 培養(yǎng)條件下， 上述篩選得到的最佳氮源，考察其濃度（5g/L、 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L）對(duì)菌株液體 發(fā)酵活菌數(shù)的影響。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

1.5.5 接種量

在 LB 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間為 48h 的條件下， 研究接種量 1%、3%、5%、7%、10%、對(duì)菌株液體 發(fā)酵的影響。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵條件的確定

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間分別為 24h、36h、48h、60h、72h 時(shí)， 對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為 8.1×107 CFU/mL 、 2.68× 108 CFU/mL、3.8×108 CFU/mL、3.3×108 CFU/mL、 2.6×108 CFU/mL，活菌數(shù)在 48 h 時(shí)達(dá)到最大值，故 選擇 48 h 作為發(fā)酵時(shí)間。

2.1.2 碳源種類(lèi)

由圖 1 可知，不同種類(lèi)的碳源對(duì)解淀粉芽孢桿 菌活菌數(shù)的影響很大（P＜0.05），其中可溶性淀粉、 玉米淀粉能明顯促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，乙酸鈉、丁二酸鈉 對(duì)菌株 DM1 生長(zhǎng)影響不明顯（P＞0.05），葡萄糖不 利于菌株生長(zhǎng)（P＜0.05）?？扇苄缘矸蹫榫曜罴?碳源。

2.1.3 可溶性淀粉濃度的優(yōu)化

可溶性淀粉濃度分別為 5g/L、10g/L、15g/L、 20g/L、25g/L 及 30g/L 時(shí)，菌株 DM1 活菌數(shù)從 3.2×108 CFU/mL 、依次降至 2.35×108 CFU/mL 、 2.2×108 CFU/mL、2.4×108 CFU/mL、2.0×108 CFU/mL、 2.1×108 CFU/mL。5g/L 為可溶性淀粉最優(yōu)添加濃度， 此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值。


2.1.4 氮源的篩選

由圖 2 可知，不同氮源對(duì) DM1 菌株活菌數(shù)具 有顯著的影響（P＜0.05）。當(dāng)酵母粉︰胰蛋白胨= 2︰1 時(shí)，DM1 菌株活菌數(shù)均達(dá)到最大值；其次是 酵母粉︰胰蛋白胨=1︰1，當(dāng)酵母粉︰胰蛋白胨= 3︰1 時(shí)，與空白對(duì)照相比，活菌數(shù)略微降低，硫酸 銨、尿素不利于菌株生長(zhǎng)（P＜0.05）。以酵母粉︰ 胰蛋白胨=2︰1 作為優(yōu)選氮源。

2.1.5 優(yōu)選氮源濃度的優(yōu)化

按照 2.1.4 節(jié)中研究結(jié)果，以酵母粉︰胰蛋白 胨=2︰1 作為氮源，考察不同的氮源濃度對(duì)菌株 DM1 發(fā)酵培養(yǎng)的影響（圖 3）。隨著氮源濃度的增 加，菌株的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，在氮 源濃度為 10g/L 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)礉舛?≥15g/L 時(shí)，活菌數(shù)迅速下降。優(yōu)選的氮源濃度為 10g/L。

2.1.6 接種量

不同接種量對(duì)菌株發(fā)酵影響。在接種量 為 7%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，為 6.5×108 CFU/mL。 故選擇 7%為最優(yōu)接種量。

2.1.7 菌懸液的制備

采用上述實(shí)驗(yàn)篩選獲得的條件，即 5g/L 可溶性 淀粉、10g/L 氮源（酵母粉︰蛋白胨=2︰1）、接種 量 7%、搖瓶裝液量 40%，搖床 200 r/min、30℃條 件下?lián)u瓶發(fā)酵 48h 制備菌液，菌液活菌數(shù)為 8.3× 108 CFU/mL，明顯優(yōu)于優(yōu)化前的 3.8×108 CFU/mL。 菌懸液獲取方法：發(fā)酵液在 4000r/min 條件下離心 10min，棄上清，得菌泥。使用滅菌后生理鹽水將 菌泥配成活菌數(shù)約為 1×109 CFU/mL 的菌懸液。

3 結(jié)論

在搖瓶發(fā)酵條件為 5g/L 可溶性淀粉、10g/L 氮源（酵母粉︰蛋白胨=2︰1）、接種量 7%、搖瓶裝 液量40%，搖床200r/min、30℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h， 菌液活菌數(shù)為 8.3×108 CFU/mL。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度 180℃、 熱風(fēng)流量 315m3 /h、進(jìn)樣速度 500mL/h、麥芽糊精 濃度 5%條件下，解淀粉芽孢桿菌菌粉活菌數(shù)可達(dá) 1.28×1010CFU/g。



 

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