長(zhǎng)期接觸砷是一種普遍的威脅人類健康的環(huán) 境健康問(wèn)題，高濃度的砷會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性， 急性暴露在高濃度的砷環(huán)境會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生輕微 持久的周圍神經(jīng)病變，慢性暴露會(huì)導(dǎo)致感官缺陷和 神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷。人參皂苷 Rb1( ginsenoside Rb1) 是中藥人參的主要有效成分之一，具有抗衰 老、抗氧化、提高免疫力和增強(qiáng)記憶力等功效。研 究顯示，人參皂苷 Rb1 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著 重要作用，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞周圍突觸的生長(zhǎng)起 到保護(hù)神經(jīng)元的作用。但人參皂苷 Rb1 對(duì)砷損 傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制尚未明確。本研究旨在基 于 AKT /GSK-3β /NFAT 途徑探討人參皂苷 Rb1 對(duì) 砷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞———嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞( pheochromocytoma cell，PC12) 毒性的抑制作用及作用機(jī)制。

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞 PC12 細(xì)胞，購(gòu)買 于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心。 人參皂苷 Rb1 購(gòu)買自南京春秋生物工程有限 公司( 純度≥98%) 。DMEM 培養(yǎng)液( 美國(guó) Sigma 公 司) ; 新生牛血清( 美國(guó) Gibco 公司) ; 噻唑藍(lán)( methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) ( 美國(guó) Hyclone 公司) ; 胰 蛋白酶( 美國(guó) Amresco 公司) ; RIPA 裂解液( 美國(guó) Amresco 公司) ; DCFH-DA( 2'，7'-二氯四氟乙烷雙乙 酸鹽) 、活性氧( reactive oxygen species，ROS) 檢測(cè)試 劑盒( 碧云天生物技術(shù)研究所) ; 蛋白激酶 B( protein kinase B，AKT ) 、糖 原 合 成 酶 激 酶 3β ( glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β) 、活 化 T 細(xì) 胞 核 因 子 ( nuclear factor of activated T cell，NFAT) 、B 淋巴細(xì) 胞瘤 2 蛋白( B-cell lymphoma-2，Bcl-2) 、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白( Bcl-2 associated X protein，Bax) 、半胱氨酸蛋 白酶 3( Caspase-3) 、β-actin 一抗( 美國(guó) Santa 公司) ; WB 試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技( 中國(guó)) 有限公司;其他試劑均為化學(xué)分析純。

電子分析天平( 上海梅特勒-托利多有限公司， 型號(hào) AR2130) ; 離心機(jī)( 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限 公司，型號(hào) TD5B) ; 超凈工作臺(tái)( 濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械 有限公司，型號(hào) BBS-DDC) ; 細(xì)胞計(jì)數(shù)器( 美國(guó) Nexcelom Bioscience LLC 公司) ; 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱( 德國(guó) Heraeus 公司，型號(hào) HERAcell) ; 高壓滅菌鍋( 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號(hào) BXM-50VD) ; 酶標(biāo)儀( 美國(guó) NanoDrop 公司) ; 倒置相差顯微鏡( 日 本 Olympus 公司，型號(hào) IX81) ; 細(xì)胞培養(yǎng)板/皿、離心 管、EP 管 ( eppendorf 管) 、凍 存 管、無(wú) 菌 鑷 ( 美 國(guó) Costar 公司) ; 流式細(xì)胞儀( 美國(guó) Beckman Coulter 公 司) ; 超 低 溫 冰 箱 ( 日 本 Sanyo 公 司，型 號(hào) MDF382E) ; 電熱恒溫水浴箱 ( 德 國(guó) HETO 公 司) ; Western blot 蛋 白 顯 影 儀 ( 美 國(guó) Protein Simple 公 司) 。

采用 DMEM 培養(yǎng)液( 含 10%胎牛血清+100 kU/ L 青霉素+100 mg /L 鏈霉素) 在 37 ℃、5%CO2、飽和 濕度的 條 件 下 培 養(yǎng) PC12 細(xì) 胞，每 隔 2 天 更 換 DMEM 培 養(yǎng) 液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù) 實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PC12 細(xì)胞，用 DMEM 培養(yǎng)液 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 1×109 /L，接種于 96 孔培養(yǎng)板中， 置于 5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。每孔加入不 同濃度( 0、2. 5、5、10、15、20、50 μmol /L) 硫化砷( arsenic sulfide) ，每個(gè)濃度重復(fù) 3 孔，以二甲基亞砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO) 為 空 白 對(duì) 照，培 養(yǎng) 24、 48、72 h 后，每孔加入 5 g /L MTT 溶液 20 μL，37 ℃ 孵育 4 h。棄去上清液，少量 DMEM 培養(yǎng)液洗滌 2 ～ 3 次后加 DMSO 100 μL 溶解晶體，用振蕩器搖勻， 使沉淀充分溶解后，使用酶標(biāo)儀在 570 nm 波長(zhǎng)處測(cè) 得各孔吸光度( absorbance，A) 值，依據(jù)下列公式計(jì)PC12 細(xì) 胞 的 增 殖 率: 細(xì) 胞 增 殖 率 = 實(shí) 驗(yàn) 組 A570 nm /對(duì)照組 A570 nm ×100%。

給予不同濃度硫化砷處理 PC12 細(xì)胞 24、48、72 h 后，對(duì)照組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞有活力; 硫化砷干 預(yù)后細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，活性降低，且隨著硫化砷濃度 的增加損傷更為顯著; 隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞 的活性降低加劇，細(xì)胞之間的連接逐漸稀疏。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細(xì)胞 24 h，A 值隨著 人參皂 苷 Rb1 濃度的改變逐漸發(fā)生變化，表 明 PC12 細(xì)胞的增殖能力發(fā)生了不同程度的變化，人參 皂苷 Rb1 對(duì)硫化砷損傷的 PC12 細(xì)胞有保護(hù)作用， 且其保護(hù)作用與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細(xì)胞 24 h，與對(duì)照組 相比，20 μmol /L 硫化砷組 PC12 細(xì)胞的凋亡率明顯 上升; 與 20 μmol /L 硫化砷組相比，人參皂苷 Rb1 組 PC12 細(xì)胞的凋亡率明顯降低，說(shuō)明人參皂苷 Rb1 可有效抑制硫化砷誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞的凋亡，并且 呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細(xì)胞 24 h，與對(duì)照組 相比，20 μmol /L 硫化砷組 PC12 細(xì)胞內(nèi) ROS 的含 量明顯增多; 與 20 μmol /L 硫化砷組相比，人參皂苷 Rb1 組 PC12 細(xì)胞的 ROS 含量明顯降低，并且呈現(xiàn) 藥物濃度依賴性。

人參皂苷 Rb1 是人參二醇系皂苷的主要代表 成分之一，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著重要作用。 有研究報(bào)道，采用人參皂苷 Rb1 治療皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞 受到氧自由基損傷的大鼠，結(jié)果神經(jīng)細(xì)胞抗自由基 的能力增強(qiáng)，緩解了神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，起到保護(hù) 神經(jīng)細(xì)胞的作用。另外，人參皂苷 Rb1 還能通過(guò) 改變胞膜的流動(dòng)性緩解神經(jīng)細(xì)胞老化，它可以促進(jìn) 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，使細(xì)胞生物膜維持在穩(wěn)定狀 態(tài)，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。