長期接觸砷是一種普遍的威脅人類健康的環(huán) 境健康問題，高濃度的砷會對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性， 急性暴露在高濃度的砷環(huán)境會導致機體產(chǎn)生輕微 持久的周圍神經(jīng)病變，慢性暴露會導致感官缺陷和 神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷。人參皂苷 Rb1( ginsenoside Rb1) 是中藥人參的主要有效成分之一，具有抗衰 老、抗氧化、提高免疫力和增強記憶力等功效。研 究顯示，人參皂苷 Rb1 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著 重要作用，通過促進神經(jīng)元細胞周圍突觸的生長起 到保護神經(jīng)元的作用。但人參皂苷 Rb1 對砷損 傷神經(jīng)細胞的保護機制尚未明確。本研究旨在基 于 AKT /GSK-3β /NFAT 途徑探討人參皂苷 Rb1 對 砷誘導的神經(jīng)細胞———嗜鉻細胞瘤細胞( pheochromocytoma cell，PC12) 毒性的抑制作用及作用機制。

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞 PC12 細胞，購買 于中國科學院上海生命科學研究院細胞中心。 人參皂苷 Rb1 購買自南京春秋生物工程有限 公司( 純度≥98%) 。DMEM 培養(yǎng)液( 美國 Sigma 公 司) ; 新生牛血清( 美國 Gibco 公司) ; 噻唑藍( methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) ( 美國 Hyclone 公司) ; 胰 蛋白酶( 美國 Amresco 公司) ; RIPA 裂解液( 美國 Amresco 公司) ; DCFH-DA( 2'，7'-二氯四氟乙烷雙乙 酸鹽) 、活性氧( reactive oxygen species，ROS) 檢測試 劑盒( 碧云天生物技術研究所) ; 蛋白激酶 B( protein kinase B，AKT ) 、糖 原 合 成 酶 激 酶 3β ( glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β) 、活 化 T 細 胞 核 因 子 ( nuclear factor of activated T cell，NFAT) 、B 淋巴細 胞瘤 2 蛋白( B-cell lymphoma-2，Bcl-2) 、Bcl-2 相關 X 蛋白( Bcl-2 associated X protein，Bax) 、半胱氨酸蛋 白酶 3( Caspase-3) 、β-actin 一抗( 美國 Santa 公司) ; WB 試劑盒購自賽默飛世爾科技( 中國) 有限公司;其他試劑均為化學分析純。

電子分析天平( 上海梅特勒-托利多有限公司， 型號 AR2130) ; 離心機( 長沙湘智離心機儀器有限 公司，型號 TD5B) ; 超凈工作臺( 濟南來寶醫(yī)療器械 有限公司，型號 BBS-DDC) ; 細胞計數(shù)器( 美國 Nexcelom Bioscience LLC 公司) ; 恒溫細胞培養(yǎng)箱( 德國 Heraeus 公司，型號 HERAcell) ; 高壓滅菌鍋( 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號 BXM-50VD) ; 酶標儀( 美國 NanoDrop 公司) ; 倒置相差顯微鏡( 日 本 Olympus 公司，型號 IX81) ; 細胞培養(yǎng)板/皿、離心 管、EP 管 ( eppendorf 管) 、凍 存 管、無 菌 鑷 ( 美 國 Costar 公司) ; 流式細胞儀( 美國 Beckman Coulter 公 司) ; 超 低 溫 冰 箱 ( 日 本 Sanyo 公 司，型 號 MDF382E) ; 電熱恒溫水浴箱 ( 德 國 HETO 公 司) ; Western blot 蛋 白 顯 影 儀 ( 美 國 Protein Simple 公 司) 。

采用 DMEM 培養(yǎng)液( 含 10%胎牛血清+100 kU/ L 青霉素+100 mg /L 鏈霉素) 在 37 ℃、5%CO2、飽和 濕度的 條 件 下 培 養(yǎng) PC12 細 胞，每 隔 2 天 更 換 DMEM 培 養(yǎng) 液，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù) 實驗。

取對數(shù)生長期的 PC12 細胞，用 DMEM 培養(yǎng)液 調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×109 /L，接種于 96 孔培養(yǎng)板中， 置于 5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。每孔加入不 同濃度( 0、2. 5、5、10、15、20、50 μmol /L) 硫化砷( arsenic sulfide) ，每個濃度重復 3 孔，以二甲基亞砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO) 為 空 白 對 照，培 養(yǎng) 24、 48、72 h 后，每孔加入 5 g /L MTT 溶液 20 μL，37 ℃ 孵育 4 h。棄去上清液，少量 DMEM 培養(yǎng)液洗滌 2 ～ 3 次后加 DMSO 100 μL 溶解晶體，用振蕩器搖勻， 使沉淀充分溶解后，使用酶標儀在 570 nm 波長處測 得各孔吸光度( absorbance，A) 值，依據(jù)下列公式計PC12 細 胞 的 增 殖 率: 細 胞 增 殖 率 = 實 驗 組 A570 nm /對照組 A570 nm ×100%。

給予不同濃度硫化砷處理 PC12 細胞 24、48、72 h 后，對照組細胞排列緊密，細胞有活力; 硫化砷干 預后細胞出現(xiàn)皺縮，活性降低，且隨著硫化砷濃度 的增加損傷更為顯著; 隨著作用時間的延長，細胞 的活性降低加劇，細胞之間的連接逐漸稀疏。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細胞 24 h，A 值隨著 人參皂 苷 Rb1 濃度的改變逐漸發(fā)生變化，表 明 PC12 細胞的增殖能力發(fā)生了不同程度的變化，人參 皂苷 Rb1 對硫化砷損傷的 PC12 細胞有保護作用， 且其保護作用與藥物濃度呈現(xiàn)一定的依賴性。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細胞 24 h，與對照組 相比，20 μmol /L 硫化砷組 PC12 細胞的凋亡率明顯 上升; 與 20 μmol /L 硫化砷組相比，人參皂苷 Rb1 組 PC12 細胞的凋亡率明顯降低，說明人參皂苷 Rb1 可有效抑制硫化砷誘導的 PC12 細胞的凋亡，并且 呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。5、10、20 μmol /L 人 參 皂 苷 Rb1 分 別 與 20 μmol /L 硫化砷共同處理 PC12 細胞 24 h，與對照組 相比，20 μmol /L 硫化砷組 PC12 細胞內(nèi) ROS 的含 量明顯增多; 與 20 μmol /L 硫化砷組相比，人參皂苷 Rb1 組 PC12 細胞的 ROS 含量明顯降低，并且呈現(xiàn) 藥物濃度依賴性。

人參皂苷 Rb1 是人參二醇系皂苷的主要代表 成分之一，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著重要作用。 有研究報道，采用人參皂苷 Rb1 治療皮質(zhì)神經(jīng)細胞 受到氧自由基損傷的大鼠，結(jié)果神經(jīng)細胞抗自由基 的能力增強，緩解了神經(jīng)元細胞的損傷，起到保護 神經(jīng)細胞的作用。另外，人參皂苷 Rb1 還能通過 改變胞膜的流動性緩解神經(jīng)細胞老化，它可以促進 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，使細胞生物膜維持在穩(wěn)定狀 態(tài)，達到保護神經(jīng)元的作用。