microＲNA 是一類廣泛存在于真核生物中不編碼 蛋白質(zhì)的短序列 ＲNAs 分子，在體內(nèi)通過與靶基因的 3 ＇端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，形成 ＲNA 誘導(dǎo)復(fù)合體，下調(diào) 相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。目 前 多 項 研 究 發(fā) 現(xiàn)miＲ-125b 可通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白 酶、Bcl-2 家族成員等，與腫瘤、免疫性疾病、血液系統(tǒng) 及心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)材料

Jurkat T 細(xì)胞株及 293T 細(xì)胞株均購 自中國科學(xué)院昆明動物研究所。

1． 2 實(shí)驗(yàn)試劑

hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒過表達(dá)載體 ( mimic) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒過表達(dá)載體陰性對 照( mimic-nc) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載體( inhibitor) 、hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載體陰性對照 ( inhibitor-nc ) ，美 國 GeneCopoeia 公 司，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑( 美國 Invitrogen 公司) ，DH5α 感受態(tài)細(xì) 胞( 日本 Takara 公司) ，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒( 北 京天根生化科技有限公司) ，胎牛血清( 美國 Gibco 公 司) ，DMEM 培養(yǎng)基、ＲPMI 1640 培養(yǎng)基( 美國 Hyclone 公司) ，Ｒneasy MiNi Kit ( 德 國 Qiagen 公 司) ，All-inOneTM miＲNA qＲT-PCＲ Detection Kit、All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit ( 美 國 GeneCopoeia 公 司) ，ＲIPA Buffer、Protease Inhibitor Cocktail( 美國 SIGMA 公司) ，β-actin 抗體、UVＲAG 抗體、goat anti-rabbit IgG-HＲP( 美國 Santa Cruz 公司) 。

1． 3 實(shí)驗(yàn)儀器

7500 型快速實(shí)時熒光定量 PCＲ 儀 ( 美國 ABI 公司) ，普通 PCＲ 儀( 深圳市賽泰克生物科技有限公司) ，垂直電泳儀和膜轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像系 統(tǒng)( 美國 Bio-rad 公司) ，細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國 Thermo 公 司) ，微量核酸濃度測定儀( 美國 Thermo 公司) ，臺式 冷凍離 心 機(jī)( 美 國 Thermo 公 司) ，低 速 離 心 機(jī) ( SC3616，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司) ，上海博迅BSC-1300B2生物安全柜 ，普通倒置 顯微鏡、熒光倒置顯微鏡( 日本 Olympus 公司) 。

1． 4 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒載體及包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌中及擴(kuò)增

采用 CaCl2 法將 miＲ-125b-5p 慢 病毒載體及包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5α 大腸桿菌，挑選氨 芐青霉素抗性的單個菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，無內(nèi)毒素質(zhì) 粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，行瓊脂糖凝膠電泳觀察及 攝像。

1． 5 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

液氮中取出 Jurkat T 細(xì)胞及 293T 細(xì)胞，37 ℃ 水浴化凍，Jurkat T 細(xì)胞加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 ＲPMI 1640 培養(yǎng)基，293T 細(xì)胞加入 含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長至約 90% 密度時 傳代。

1． 6 慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染前 24 h 取對數(shù)生長期的 293T 細(xì)胞進(jìn)行傳代，加入無抗菌藥物的含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長達(dá) 70% 融合時，按照 脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 說明書將 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒過表達(dá)載體或 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載 體及相應(yīng)對照載體和 psPAX2、pMD2． G 共同組成慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，置于 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng) 箱中孵育 24 h 后棄上清，加入含 10% 胎牛血清、1% PS 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h。熒光倒置顯微鏡觀察 293T 細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，收集富含慢病毒顆粒的細(xì) 胞上清液，3 000 r/min 離心 10 min，離心半徑 9 cm，去 除沉淀。

2 結(jié) 果

瓊脂糖凝膠電泳顯示 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒 過表達(dá)載體及對照，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載體 及對照，慢病毒包裝質(zhì)粒 psPAX2、pMD2． G 與理想大 小相符合，可用于轉(zhuǎn)染 Jurkat T 細(xì)胞。利用慢病毒載體與包裝質(zhì)粒( psPAX2、pMD2． G) 共同轉(zhuǎn)染 293T 細(xì) 胞，熒光倒置顯微鏡觀察 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒過表 達(dá)載體及對照載體組 293T 細(xì)胞均可見大量的綠色熒 光，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載體及對照載體組 293T 細(xì)胞均可見大量的紅色熒光。利用成功包裝 的慢病毒顆粒感染 Jurakat T 細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察 hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒過表達(dá)載體及對照載體組的 Jurkat T 細(xì)胞內(nèi)均有明亮的綠色熒光表達(dá)。hsa-miＲ125b-5p 慢病毒干擾載體及對照載體組的 Jurkat T 細(xì) 胞內(nèi)均有明亮的紅色熒光表達(dá)。和對照載體組比較，hsa-miＲ-125b-5p 慢 病毒過表達(dá)載體組 miＲ-125b-5p 表達(dá)水平明顯增高 ( P ＜ 0． 01) ，hsa-miＲ-125b-5p 慢病毒干擾載體組 miＲ125b-5p 表達(dá)水平明顯降低( P ＜ 0． 01) ，差異均有統(tǒng)計 學(xué)意義，見圖 1。

3 討 論

miＲ-125b-5p 屬于 miＲ-125 家族，miＲ-125 包括 hsamiＲ-125a 及 hsa-miＲ-125b 兩個亞家族，其中轉(zhuǎn)錄 miＲ125a 的基因位于染色體 19q13 上，而 miＲ-125b 由染色 體 11q23 和 21q2 兩個位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄并分別形成 miＲ-125b-1 和 miＲ-125b-2。共 包 含 5 個 成 熟 體 miＲNA: miＲ125a-3p、miＲ-125a-5p、miＲ-125b-1-3p、miＲ-125b-2-3p 和 miＲ-125b-5p，其中 miＲ-125b-5p 和 miＲ-125a-5p 的堿基 序列高度相似，miＲ-125b-1-3p 和 miＲ-125b-2-3p 的堿基 序列高度相似。miＲ-125 的表達(dá)具有高度保守性及廣泛 性。miＲ-125 家族最早由 Lagos-Quintana M 等于 2002 年在小鼠中發(fā)現(xiàn)并測序。2005 年 Lee Y S 等首次對 miＲ-125b-5p 的功能進(jìn)行報道，發(fā)現(xiàn)其是分化的腫瘤細(xì) 胞增殖過程中的關(guān)鍵因子。至目前為止，已有大量研究 證實(shí)其在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化、腫瘤抑制、 線粒體生物合成、細(xì)菌感染等病理生理過程中的 作用，其差異性表達(dá)也和多種疾病如急性心肌梗死、 多發(fā)性骨髓瘤、急性缺血性中風(fēng)、肝細(xì)胞癌、骨 關(guān)節(jié)炎等有關(guān)。



 

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