脊髓損傷（ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ）具有致殘率 高、后期康復(fù)及生活負(fù)擔(dān)重等特點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）作為種子細(xì)胞 定向移植可 促 進(jìn) ＳＣＩ修 復(fù) 及 功 能 恢 復(fù) 已 得 到 廣 泛 的證實(shí)。但是，ＢＭＳＣｓ定向移植后因細(xì)胞生長環(huán) 境改變、脊髓原發(fā)性損傷炎性反應(yīng)以及脊髓損傷后 相關(guān)抑制性信號通路開放所致繼發(fā)性損傷導(dǎo)致移植 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、生長緩慢、分化抑制等難題。相 關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為繼發(fā)性損傷所導(dǎo)致的病理生理變化對神 經(jīng)功能恢復(fù)起決定性作用，而相關(guān)抑制性信號通路 開放所致趨 化 因 子 和 細(xì) 胞 因 子 的 活 化 正 是 ＳＣＩ后招募、激活炎性細(xì)胞的扳機(jī)點(diǎn)，從而進(jìn)一步加重 ＳＣＩ 的繼發(fā)性損 傷。

１ 材料與方法

１．１ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選 取５只 周 齡 為３～４周、 體質(zhì)量為１００ｇ健 康 雄 性 ＳＤ 大 鼠 用 于 ＢＭＳＣｓ的 提取，選取８０只周齡為８周、體質(zhì)量３００ｇ雄性ＳＤ 大鼠用于制作模型。ＳＤ大鼠均為清潔級，由新疆醫(yī) 科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué) 第一 附 屬 醫(yī) 院 動(dòng) 物倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （編 號： ＩＡＣＵＣ２０１６１２０８－０５）。將８０只 大 鼠 根 據(jù) 不 同 實(shí) 驗(yàn) 干預(yù)措 施 隨 機(jī) 分 為 ＳＣＩ模 型 組、ＢＭＳＣｓ移 植 組、 Ｆａｓｄｉｕａｌ治療組、聯(lián)合治療組（２０只／組）。

１．２ 試劑及儀器設(shè)備

胎牛血清、低糖 ＤＭＥＭ 培 養(yǎng)基、ＰＢＳ緩沖液、雙抗、０．５％胰蛋白酶（美國 Ｈｙ－ ｃｌｏｎｅ公司）；神經(jīng)元性特異性烯醇化酶（ＮＳＥ）抗體、 膠質(zhì)纖維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗體及四甲基異硫氰酸 羅丹明（ＴＲＩＴＣ）標(biāo)記的羊抗兔ＩｇＧ 抗體、二脒基苯 基吲哚（ＤＡＰＩ）復(fù)染液（武漢博士德公司），神經(jīng)絲蛋 白（ＮＦ２００）抗 體（北 京 博 奧 森 公 司）。超 凈 工 作 臺 （蘇凈安泰），高速離心機(jī)（美國 Ｔｈｅｒｍｏ公司）倒 置 相差顯微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ），恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療股份有限公司），圖像采集設(shè)備（ｆｅｃｉａＤＭ３０００）。

１．３ ＢＭＳＣｓ的提取、培養(yǎng)、純化及鑒定

無菌條件 下取出５只周齡３～４周、體質(zhì)量為１００ｇ大鼠的雙 側(cè)股骨及脛骨，置 于５％雙 抗 的 ＤＭＥＭ 中，用 低 糖 ＤＭＥＭ 反復(fù)沖洗骨髓腔，反 復(fù) 吹 打 成 單 細(xì) 胞 懸 液， 清洗、離心細(xì) 胞２ 次 去 除 肉 眼 可 見 的 雜 質(zhì) 及 油 脂。 用含體積分?jǐn)?shù)１２％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 制作單細(xì)胞 懸液接種于 培 養(yǎng) 瓶 中，置 于３７℃、５％ ＣＯ２ 恒 溫 培 養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，７２ｈ 首次換液棄去未貼壁的 懸浮細(xì) 胞，之 后 每 ３ 天 換 一 次 液，當(dāng) 細(xì) 胞 生 長 至 ８０％ ～ ９０％時(shí)，進(jìn)行胰酶消化傳代（１∶３傳代），第３代 細(xì) 胞已經(jīng)去除非貼壁的骨髓造血干細(xì)胞，得到純化的 ＢＭＳＣｓ，使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測。移植前用毛 細(xì)吸管反復(fù)吹打分離細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液，ＰＢＳ洗 滌２次，調(diào)整細(xì)胞密度為１×１０６ 個(gè)／μＬ，移植備用。

１．４ ＳＣＩ大鼠模型制作

取ＳＤ大鼠用１０％水合氯 醛腹腔注射 麻 醉（３００ ｍｇ／ｋｇ）后，麻 醉 生 效 后 固 定 于解剖板上備皮消毒，以胸１０為中心做５ｃｍ 長切 口，逐層分離暴露胸９、１０、１１棘突和椎板，咬除棘突 及椎板充分暴露脊髓。根據(jù)改良 Ａｌｌｅｎ法用５ｇ砝 碼從１６ｃｍ 高度通過適當(dāng)粗細(xì)的玻璃試管自由下 落，砝碼柄端朝下，打擊面積約３．０ｍｍ２。砝碼自由 落下打擊到脊髓時(shí)大鼠迅速出現(xiàn)雙下肢回縮撲動(dòng)及 擺尾動(dòng)作，隨后出現(xiàn)遲緩性癱瘓，迅速移除砝碼后可 見脊髓充血 水 腫，提 示 ＳＣＩ模 型 制 作 成 功，生 理 鹽 水沖洗后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后膀胱按摩３～５次／ｄ， 促進(jìn)反射性排尿至恢復(fù)正常排尿，２０萬 Ｕ／ｋｇ青霉 素皮下注射３～５ｄ預(yù)防切口及泌尿系感染。

１．５ 干預(yù)方法

ＳＣＩ模型組：脊髓損傷模型制作成 功后 逐 層 關(guān) 閉 切 口，３０ ｍｉｎ 后 腹 腔 注 射 １ ｍＬ 的 ０．９％氯化鈉注射液。ＢＭＳＣｓ移植組：脊髓損傷模型 制作成功后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的０．９％氯化鈉注 射液，術(shù)后５ｄ沿原切口切開暴露脊髓損傷節(jié)段，硬 膜下注射１０μＬ的１×１０６／μＬ骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單 細(xì)胞懸液。Ｆａｓｄｉｕａｌ治療組：脊髓損傷模型制作成功 后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ）， 術(shù)后５ｄ沿原切口切開暴 露 脊 髓 損 傷 節(jié) 段，硬 膜 下 注射１０μＬ０．９％氯化鈉注射液。聯(lián)合治療組：脊髓 損傷模型制作成功后 ３０ ｍｉｎ 腹 腔 注 射１ｍＬ Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ），術(shù)后５ｄ天沿原切口切開暴 露脊髓損傷節(jié)段，硬膜下注射１０μＬ１×１０６ 個(gè)／μＬ骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液。

１．６ 運(yùn)動(dòng)功能評分

由 本 課 題 組２名 研 究 人 員 采 用 ＢＢＢ（ｂａｓｓｏ－ｂｅａｔｔｉｅ－ｂｒｅｓｎａｈａｎ）評 分 法 分 別 于 ＳＣＩ術(shù)后第１、７、１４、２１、２８天同一時(shí)間段對各組大鼠 后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評分，評分范圍０～２１分，０分為無 后肢運(yùn)動(dòng)，２１分為后肢正常運(yùn)動(dòng)，評分取平均值。

１．７ 組織學(xué)觀察

ＳＣＩ術(shù)后第２８天各組大鼠腹腔 注射１０％水合氯醛，麻醉處死各 組 ＳＣＩ大 鼠，按 原 切口進(jìn)入，以損傷脊髓節(jié)段為中心切取約１ｃｍ 長度 完整脊髓組織，置于４％多聚甲醛固定４８ｈ，常規(guī)梯 度脫水、石蠟包埋。取蠟塊制片，厚度４μｍ，６０℃烤 箱烤片過夜備用。切片經(jīng)脫蠟、脫水、透明后分別進(jìn) 行 ＨＥ、免疫組 織 化 學(xué)、免 疫 熒 光 染 色，鏡 下 觀 察 脊 髓標(biāo) 本 形 態(tài) 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 以 及 ＮＳＥ、ＮＦ２００、ＧＦＡＰ 的 表達(dá)。

１．８ 免疫組織化

學(xué) 半 定 量 分 析 采 用Ｉｍａｇｅ－Ｒｒｏ－ Ｐｌｕｓ圖像分析軟件對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行 分析，根據(jù)陽性染色細(xì)胞及染色強(qiáng)度計(jì)算出光密度 值，用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

１．９ 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采 用 ＳＰＳＳ１７．０軟 件 進(jìn) 行 統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn) 差 （ｘ－ ±ｓ）表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩 比較 采 用 ＳＮＫ－ｑ，以 Ｐ ＜０．０５ 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

２ 結(jié)果

初次換液后原代細(xì)胞呈集 落分布于培養(yǎng)瓶，經(jīng)傳代后均勻生長，３代細(xì)胞均勻 分布，細(xì)胞呈梭形。３代細(xì)胞表型 ＣＤ２９、ＣＤ４５的陽 性率分別為８２．４％、２．０％，見圖１。


各 組 ＳＣＩ大 鼠 術(shù) 后１ｄ評 分 均 位 于較低水平，運(yùn)動(dòng)范圍為無運(yùn)動(dòng)到１～２個(gè)關(guān)節(jié)的輕 微運(yùn)動(dòng)，術(shù)后１～２８ｄ各組 ＳＣＩ大鼠運(yùn)動(dòng)功能均有 改善，以術(shù)后１４～２８ｄ改 善 幅 度 相 對 較 大，以 聯(lián) 合治療組運(yùn)動(dòng)改善效果最佳，聯(lián)合治療組在損傷第１４ 天開始ＳＣＩ大鼠 ＢＢＢ評分逐漸優(yōu)于其余治療組，且 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０５），見表１。ＳＣＩ術(shù)后第２８天觀察各組標(biāo)本 ＨＥ 結(jié)果顯示聯(lián)合治療組脊髓傷修復(fù)效果明顯，脊髓空洞面積最 小，其 次 為 ＢＭＳＣｓ移 植 組 和 Ｆａｓｄｉｕａｌ治 療組，而ＳＣＩ模 型 組 空 洞 面 積 最 大，損 傷 組 織 的 修 復(fù)效果較差，見圖２。ＢＭＳＣｓ移植組、Ｆａｓｄｉｕａｌ治療 組和聯(lián)合治 療 組 分 別 與 ＳＣＩ模 型 組 相 比 差 異 均 有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０５），見表２。

３ 討論

脊髓損傷（ＳＣＩ）由初始的原發(fā)性和漸進(jìn)的繼發(fā) 性兩部分損傷共同所致。目前，因各種外傷 因 素 造成脊髓結(jié)構(gòu)破壞的原發(fā)性損傷還無法可控，僅限 于手術(shù)解除壓迫為脊髓恢復(fù)創(chuàng)造有利條件；然而，以 脊髓水腫、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元不能再 生一系列聯(lián)動(dòng)的繼發(fā)性損傷是可以干預(yù)的，也是當(dāng) 前解決脊髓損傷再生修復(fù)的研究方向。脊髓損傷 后軸突再生和正確靶向是損傷后脊髓修復(fù)與功能重 建的難點(diǎn)，干細(xì)胞移植治療脊髓損傷能很好解決這一難題，其 中 的 ＢＭＳＣｓ定 向 分 化 移 植 是 最 具 應(yīng) 用 前景之一。但 由 于 ＢＭＳＣｓ移 植 于 損 傷 脊 髓 后 會(huì)繼發(fā)性損傷出現(xiàn)移植細(xì)胞生存率下降、生長緩慢、 定向分化抑制等不利的方面。所以，本課題以此為 據(jù)點(diǎn)進(jìn)行研究。