近年來，隨著人們生活水平的提高，蝦類養(yǎng)殖 與海洋捕撈發(fā)展迅猛， 其中南美白對蝦已成為世 界三大養(yǎng)殖對蝦品種之一，然而由于保鮮技術(shù) 仍未能獲得實質(zhì)性突破， 原料在冷藏和運輸過程 中的黑變現(xiàn)象十分突出。 黑變對消費者雖然不會 造成安全危害，但是會顯著降低產(chǎn)品市場價值。 研 究表明，蝦類黑變與微生物作用無關(guān)，而與其體內(nèi) 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活力有關(guān)。 基于酶促褐變機理， 目前控制對蝦冷藏過程中的 黑變主要通過理化和生物方法，從階段上講屬 于末端策略， 而對蝦黑變是一個極其復(fù)雜的級聯(lián)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Fura-2/AM 熒光探針，Sigma 公司； 鼠源絲氨酸蛋白酶多克隆抗體， 上海酶聯(lián)生物科技有限公 司；二氨基聯(lián)苯胺，西安永屹生物技術(shù)有限公司； 甲醛（AR），廣州化學(xué)試劑廠；冰乙酸（AR），廣州化 學(xué)試劑廠；無水乙醇（AR），廣州化學(xué)試劑廠；三氯 甲烷（AR），衡陽市凱信化工股份有限公司；二甲 苯，廣東光華科技股份有限公司；蘇木精，中國醫(yī) 藥（集團）化學(xué)試劑公司；伊紅，國藥集團化學(xué)試劑 有限公司； 中性樹膠， 國藥集團化學(xué)試劑有限公 司。

1.2 儀器

Nikon80i 顯微鏡，日本尼康公司；MesoMR-60 低場核磁共振儀， 上海紐邁電子科技有限公司； RM2245 半自動轉(zhuǎn)輪切片機，徠卡儀器有限公司； D-37520 冷凍離心機， 上海柏辰生物科技有限公 司；JEM-2100F 場發(fā)射透射電子顯微鏡，日本電子 株式會社；BCD-166TNA 海爾冰箱，青島海爾股份 有限公司；DHG-9053A 電熱鼓風干燥箱， 上海一 恒科學(xué)儀 器 有 限 公 司；GZX-9070 數(shù) 顯 鼓 風 干 燥 箱 ， 上海博訊實業(yè)有限公 司醫(yī)療設(shè)備廠 ； BSA224S 電子分析天平， 賽多利斯科學(xué)儀器 （北 京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

體長 12～15 cm 新鮮南美白對 蝦購自湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場， 充氧保活運 輸至實驗室，選取色澤良好、肢體外殼完好、大小 一致的個體，置于冰塊中猝死，清水沖洗干凈后用 篩絹瀝干裝入保鮮盒中于 4 ℃冰箱冷藏。 在 120 h 儲藏期內(nèi)，每 24 h 采用低場核磁共振對南美白對 蝦體內(nèi)水分分布狀態(tài)進行測定， 之后取肝胰腺組 織進行組織化學(xué)樣品制備和觀察。

1.3.2 組織化學(xué)樣品制備與觀察

每隔 24 h 取 肝胰腺組織，超凈工作臺中參照 Li 等試驗方法 由代表性部位切取 5 mm×5 mm×2 mm 組 織 塊， Bouin’s 固定液中進行組織固定，固定結(jié)束后梯度 乙醇脫水，組織透明后石蠟包埋，5 μm 組織切片， 常規(guī)染色程序染色后光學(xué)顯微鏡觀察拍照。 透射 電鏡樣品制備與觀察在廣東醫(yī)科大學(xué)電鏡室完 成。

1.3.3 低場核磁共振

采用低 場核磁共振儀對南美白對蝦 4 ℃冷藏過程中的水 分狀態(tài)進行監(jiān)測， 置于 15 cm 的核磁管中然后放入磁體箱中，質(zhì)子檢測參數(shù)為共振頻率 23.3MHz， 磁體強度 0.5T±0.05T，線圈直徑為 60mm，磁體溫 度為 32 ℃，采用 T2 測試（CPMG 序列）程序?qū)Τ?豫譜圖進行分析，其參數(shù)分別為 P90（us）=21.50， P180 （us）=38.48， SW （kHz） =100， D3 （us） =0.1， TR（ms）=5 000，RG1=20， RG2=3， NS=8，TE= 0.4 ms，NECH=12 000； 采用斷面掃描程序?qū)υ隗w 水分狀態(tài)進行質(zhì)子密度圖像掃描。

1.3.4 Ca2+熒光標記與觀察

以二 甲基亞砜為溶劑配制 7.5 mmol/L Fura-2/AM 作為 Ca2+負載試劑，分裝之后-18 ℃保存，用時將脫水 處理后的石蠟切片滴加 Ca2+負載試劑，加入 0.01% 小牛血清白蛋白協(xié)助 Fura-2/AM 負載， 然后加入 5 mmol/L 的 Hepes 液在 4 ℃終止負載，15 000 g 離 心 5 min 后將所得沉淀懸浮 于 3 mL Hepes 液，4 ℃下保存并在 2 h 內(nèi)進行熒光測定。

1.3.5 絲氨酸蛋白酶免疫組織化學(xué)分析

絲氨酸 蛋白酶免疫組織化學(xué)參照進行。 組織 標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、5 μm 切片、二甲苯脫蠟、梯 度乙醇脫水處理后， 進行 0.01 mol/L 檸檬酸緩沖 液（pH=6.0）及微波抗原修復(fù)。 室溫下將玻片置于 10%山羊血清的濕盒中封閉 20 min， 之后在玻片 上滴加 SP 兔抗人多克隆抗體（1∶100），濕盒中 4 ℃ 冰箱內(nèi)過夜，第 2 天室溫下于玻片上滴加二抗，然 后濕盒內(nèi)孵育 10 min， 孵育完畢后檸檬酸緩沖液 沖洗玻片并進行二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染， 常規(guī)脫水，中性樹膠封片后顯微觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

隨著冷藏時間的延長，肝胰 腺組織中肝小管有不同程度的破裂， 冷藏初期肝 小管結(jié)構(gòu)完整，肝小管之間接觸緊密，排列規(guī)則， 肝小管內(nèi)細胞緊貼肝小管內(nèi)壁， 隨著冷藏時間的 延長肝小管逐漸呈現(xiàn)不同程度的破裂， 內(nèi)壁細胞 也逐漸由肝小管脫落， 冷藏至第 5 天時肝小管完 全失去管狀結(jié)構(gòu)，細胞呈彌散狀散落。在冷藏初期細胞骨架完整，各種成分區(qū)域化分布，然而隨著冷 藏的延續(xù)細胞骨架逐漸解體， 細胞內(nèi)各種成分開 始呈隨機化分布， 冷藏第 4、5 天時已完全失去剛 性結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)各種組分和細胞器充分接觸，使品質(zhì) 劣變的酶促反應(yīng)進一步加速，本結(jié)果在組織、細胞和亞細胞水平上為對蝦冷藏過程中因組織和細胞 骨架結(jié)構(gòu)破損而引起的細胞及其組分的聚集遷移 提供了證據(jù)， 證明肝胰腺組織及細胞骨架解體為 SP 介導(dǎo) ProPO 激活破除了結(jié)構(gòu)障礙。

3 結(jié)論

組織化學(xué)和低場核磁共振研究表明， 南美白 對蝦冷藏過程中肝胰腺細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生漸進性解 體，自由水含量隨之顯著增加，在結(jié)構(gòu)解體和自由 水加速向胞外遷移的過程中， 驅(qū)動 Ca2+和絲氨酸 蛋白酶由胞內(nèi)向胞外遷移，激活 ProPO，從而觸發(fā)和加速黑變進程。