貝萊斯芽孢桿菌( Bacillus velezensis) Tu － 569 發(fā) 酵產(chǎn)生的胞外抗菌肽可抑制大腸桿菌、沙門氏桿菌、 痢疾桿菌等致腹瀉病原菌的生長，且耐受胃腸道環(huán) 境、耐熱性好，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)極具應(yīng)用潛力。T － 70－1 菌株是由 Tu－569 菌株經(jīng)紫外－微波誘變獲得 的菌株，其產(chǎn)抗菌肽能力是原菌株的 2. 74 倍。

1 材料

1. 1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌( Bacillus velezensis) T－70－1、大腸桿菌( E． coli) ATCC 53832，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥 工程系實驗室保存。

1. 2 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉，均購自北 京奧博星生物技術(shù)有限公司; 葡萄糖、NaCl、MgSO4 · 7H2O、KCl、NaH2PO4 ·2H2O、Na2HPO4 ·2H2O 等，均購 自天津市永大化學(xué)試劑有限公司; 消泡劑，購自佛山 市南海大田化學(xué)有限公司; NB 培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基、 LB 培 養(yǎng) 基、LA 培 養(yǎng) 基、發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 ( 葡 萄 糖 25. 0 g，蛋 白 胨 20. 0 g，MgSO4·7H2O 0. 8 g，KCl 1. 0 g，NaH2PO4 ·2H2O 2. 0 g，Na2HPO4 ·2H2O 4. 0 g， 水 1 000 mL，初始 pH 值為 6. 5) ，均自制。

1. 3 主要儀器

立式壓力蒸氣滅菌鍋( YXQ－LS－100G 型) ，購自 上海博訊有限公司; 高速落地離心機(jī)( Sorvall·lynx· 6000 型) ，購自賽默飛世爾科技有限公司; 5 L 離位滅 菌玻璃發(fā)酵罐( BLBIO－ 5GJ 型) 、30 L 自動發(fā)酵罐 ( 30SJ 型) ，均購自上海百侖生物科技有限公司; 發(fā)電 機(jī)( W120 型) ，購自上海復(fù)宏機(jī)電有限公司; 溶氧電 極( OXYFEＲM FDA VP 225 型) 、pH 電極( EasyFerm Plus PHI K8 225 型) ，均購自天津恩耐德科技有限公 司; 低溫恒溫攪拌反應(yīng)浴( DHJF－4020 型) ，購自鄭州 長城科工貿(mào)有限公司; 全無油空氣壓縮機(jī)( VWYD－ 20 /0－8 型) ，購自鞍山佳朋壓縮機(jī)有限公司; 儲氣罐 ( DY02－13－14H－00 型) ，購自上海東亞壓力容器制造有限公司; 全自動電加熱蒸氣發(fā)生器( YN30－0. 7－ D 型) ，購自上海揚(yáng)諾鍋爐制造有限公司。

2 方法

改良二倍稀釋法測 定抗菌肽效價，即離心取發(fā)酵上清液作為抗菌肽樣 液，用無菌生理鹽水進(jìn)行逐步二倍稀釋，以大腸桿菌 ATCC 53832 作為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測定各 個稀釋倍數(shù)下抗菌肽發(fā)酵樣液對大腸桿菌的抗菌特 性。各個稀釋倍數(shù)下的抗菌肽發(fā)酵液樣品中以出現(xiàn) 肉眼不可見抑菌圈為終點(diǎn)。原液抗菌肽效價( 單位 為 Au) = 2n×1 000 /40，其中 n 表示不出現(xiàn)可見抑菌 圈的二倍稀釋次數(shù)，40 表示孔中加液體積( μL) 。建 立抗菌肽抗菌效價和抑菌圈面積之間的線性關(guān)系，最 后繪制出效價測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。將發(fā)酵罐清洗干凈后裝入 發(fā)酵培養(yǎng)基，蓋上上蓋，裝上 pH 電極和溶氧電極，夾 緊通氣管路、進(jìn)出水管路，并用錫紙包裹 pH 電極、溶 氧電極、消泡電極、攪拌器的頂部。檢查完畢后，放入 滅菌鍋中 115 ℃滅菌 30 min。滅菌完畢后取出發(fā)酵罐，連 接好冷卻水管( 兩進(jìn)兩出) 、出氣管、進(jìn)氣管; 組裝上 攪拌電機(jī)，插上消泡電極、溫度電極、pH 電極和溶氧 電極; 連接好消泡劑補(bǔ)加管路

3 結(jié)果與分析

發(fā)酵上清液抗菌肽效價對數(shù)值和抑 菌圈面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其中 Ｒ2 = 0. 996 5， 曲線方程為: y = 0. 004 7x+1. 600 1，其中 x 為抑菌圈 面積( mm2 ) ，y 為效價對數(shù)值。若效價超過計算范圍 則需要將樣品進(jìn)行稀釋后測定。此方法操作簡單、工 作量小、準(zhǔn)確度高、便于批量檢測。在 5 L 發(fā)酵罐最優(yōu)發(fā)酵條件下，即發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵 液體積為 2. 0 L，發(fā)酵通氣率( 即單位體積發(fā)酵液所 對應(yīng)的通氣量) 為 1. 00 L /( min·L) ，放大到 30 L 發(fā) 酵罐時，若其中發(fā)酵液體積為 20 L，則依據(jù)發(fā)酵通氣 率不變，其通氣量應(yīng)為 20. 0 L /min，即1. 2 m3 / h。故 設(shè)定 30 L 發(fā)酵罐裝液體積為 20 L，通 氣 量 為 1. 2 m3 / h，攪拌速度為 180 r /min，罐壓為 0. 05 MPa。0 ～ 12 h，隨著發(fā)酵時間的推移，pH 值逐漸降低， 第 12 小時時達(dá)到最低值，為 5. 50。這個階段菌體快 速繁殖生長，需氧量增加，pH 值降低; 隨后 pH 值逐漸升高，菌群生長趨于穩(wěn)定。

4 討論與結(jié)論

采用 二 倍 稀 釋 法 探 究 B． laterosporus S62－9 的胞外抗菌肽對 S．a(chǎn)ureus 的抑制效果，發(fā)現(xiàn)抗 菌肽發(fā)酵樣品的發(fā)酵對數(shù)值與抑菌圈直徑存在線性 關(guān)系，其抗菌效價最高可達(dá) 8 000 Au。本試驗中 T－ 70－1 菌株胞外抗菌肽的效價對數(shù)值與抑菌圈面積之 間存在線性關(guān)系，確定了原發(fā)酵液抗菌肽的效價，這 種方法既避免了人為主觀影響，又解決了抗菌肽沒有 標(biāo)準(zhǔn)品的難題。