非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV） 引起的一種急性、烈性豬傳染病，發(fā)病率、致死率 可高達(dá) 100%，危害嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)可造成毀滅性 打擊，可引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響。ASF 自 2018 年 8 月在遼寧省首發(fā)以來，已在我國多個(gè) 省份發(fā)生。為進(jìn)一步加強(qiáng) ASF 防控，新疆地區(qū) 加強(qiáng)臨床監(jiān)視、現(xiàn)場(chǎng)排查，對(duì)生豬從生產(chǎn)到屠宰全 程進(jìn)行采樣監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格控制生豬及其產(chǎn)品調(diào)運(yùn)監(jiān)管， 多部門協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)，形成了良好的工作機(jī)制。

1　材料

1.1　樣品

樣品來源：動(dòng)物公路檢查站攔截的速凍豬肉 餡水餃，其中來源于 A 廠 13 個(gè)批次、B 廠 1 個(gè)批次； 在冷庫、超市中抽檢 B 廠速凍豬肉餡水餃 11 個(gè)批 次。樣品的采集、保存和運(yùn)輸嚴(yán)格按照《非洲豬瘟 監(jiān)測(cè)樣品采集、保存與運(yùn)輸方法》中的要求，以 豬肉產(chǎn)品的批次為采樣單位，每批次按豬肉產(chǎn)品包 裝的規(guī)格（件 / 箱）隨機(jī)抽樣。數(shù)量為每批次隨機(jī) 抽取 10 件（箱），每件（箱）采集樣品 2 份，合 計(jì)每批次采集樣品 20 份。

1.2　試劑

天根磁珠法病毒 DNA/RNA 提取試劑盒（批號(hào) S7327）、DNA 病毒反應(yīng)液（批號(hào) 20181129）： 購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)公司；TaqMan 探針、ASFV 特異性引物、提取陽性對(duì)照、反應(yīng)陽性 對(duì)照：均由中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué)中心提供。

1.3　儀器設(shè)備

上海博訊電熱恒溫水槽 SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量組織研磨儀、Sigma3K-15 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、天隆 NP968 自動(dòng)核酸提取 儀、QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀。

2　方法

2.1　樣品處理

每批次每袋隨機(jī)挑取 2~3 個(gè)餃子，挑出其中 的豬肉進(jìn)行剪碎。在加有陶珠的組織研磨管中， 加入 1 mL PBS 緩沖液，再加入剪碎的樣品約 100 mg，使用 Bertin Precellys 組織研磨儀進(jìn)行勻 漿處理。處理后放入 60 ℃水浴鍋滅活 30 min，每 間隔 5 min 顛倒混勻樣品 1 次。

2.2　病毒 DNA 提取

對(duì)滅活后的樣品 4 ℃ 2 000 r/min，離心 10 min； 取 200 μL 上清液，使用磁珠法病毒 DNA 提取試 劑盒提取 DNA；將提取的核酸于 −20 ℃冰箱中保 存?zhèn)溆谩?br />
2.3　熒光定量

PCR 采 用 ASFV 特異熒光定量 PCR 方法擴(kuò)增 ASFV VP72 基因片段 。PCR 以 20 μL 體系進(jìn)行： DNA 病毒熒光反應(yīng)液 10 μL、ROX 0.2 μL、無菌無 核酸水 5.7 μL、正向引物 0.8 μL、反向引物 0.8 μL、 TaqMan 探針 0.5 μL，模板 DNA 2 μL。同時(shí)，設(shè)立 提取陽性 / 陰性對(duì)照、反應(yīng)陽性 / 陰性對(duì)照。密封 反應(yīng)試管，瞬時(shí)離心，放入熒光 PCR 儀，按照熒 光 PCR 循環(huán)條件擴(kuò)增。

3　結(jié)果

根據(jù) ASFV 檢測(cè)操作規(guī)程分析，樣品 Ct 值低 于 40 為陽性。12 月 5 日檢測(cè)的 13 個(gè)批次樣品中， 有 5 個(gè)批次檢測(cè)到 ASFV 特異性擴(kuò)增曲線，Ct 值 為 28.3~32.68（圖 1），其他批次熒光定量 PCR 檢 測(cè)結(jié)果見表 2。



4　討論

4.1　陽性豬肉產(chǎn)品的處置

新疆畜牧獸醫(yī)局接到中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué) 中心的復(fù)核確診后立即行動(dòng)，要求動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督部 門會(huì)同食品藥品監(jiān)管部門按照應(yīng)急預(yù)案開展處置工 作，銷毀陽性樣品，并通知各級(jí)食品藥品監(jiān)管部門、 畜牧獸醫(yī)等部門，對(duì)同批次產(chǎn)品進(jìn)行無害化處理， 對(duì)相關(guān)場(chǎng)所進(jìn)行徹底清洗消毒，同時(shí)繼續(xù)加強(qiáng)開展 ASF 疫情排查工作。

4.2　加強(qiáng)流調(diào)溯源

本次速凍豬肉水餃中 ASFV 核酸的確診在 國內(nèi)是首次，能從豬肉產(chǎn)品中檢出 ASFV，說明ASFV 已形成了一定污染面。此次在速凍豬肉水餃 中檢出 ASFV 核酸，推斷是由于潛伏期帶毒豬沒 有臨床癥狀，屠宰后進(jìn)入加工企業(yè)，被加工生產(chǎn)成 豬肉制品所造成的 。ASFV 自身較脆弱，對(duì)熱抵 抗力不強(qiáng)。雖然此類豬肉制品一般直接進(jìn)入餐桌， 在蒸煮烹飪過程，均能將病毒殺死，但是水餃中豬 肉的溯源應(yīng)引起主管部門的高度重視，這也是控制 疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)的重要環(huán)節(jié)。水餃在烹飪過程中，如 果未對(duì)豬肉進(jìn)行高溫處理，未煮熟的水餃會(huì)以餐廚 垃圾喂豬或進(jìn)入養(yǎng)殖戶，很容易造成 ASFV 的傳播擴(kuò)散 。其次如果在加工處理車間，人員、車輛、 污水、廢棄物處理不當(dāng)，就有可能造成病毒擴(kuò)散， 從而引發(fā)新的疫情 。因此，要加強(qiáng)產(chǎn)地檢疫和屠 宰場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬和處于潛伏期 的豬，防止問題豬肉流入食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

4.3　繼續(xù)做好 ASF 防控

目前國內(nèi) ASF 疫情仍呈點(diǎn)狀散發(fā)態(tài)勢(shì)，因豬 肉制品調(diào)入而傳播 ASF 的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此應(yīng)該警 惕通過污染病毒的豬肉制品而引發(fā)疫情的可能。 鑒于目前 ASF 防控形勢(shì)仍較嚴(yán)峻，今后仍需重點(diǎn) 排查養(yǎng)殖場(chǎng)、生豬交易市場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等高風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng) 點(diǎn)，同時(shí)加大公路檢查站對(duì)跨省入疆生豬和豬肉 產(chǎn)品的檢查和查處力度，嚴(yán)格控制從疫區(qū)調(diào)入生 豬及相關(guān)產(chǎn)品。