骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，患病人 群多集中在兒童、青少年、55 歲以上的中老年人。 骨肉瘤易發(fā)生在血運(yùn)豐富的長(zhǎng)管狀骨干骺端，早期 極有可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，且發(fā)展迅速。目前的主要 治療方式為手術(shù)切除和化療相結(jié)合，但由于復(fù)發(fā) 和耐藥發(fā)生率較高，嚴(yán)重影響了術(shù)后預(yù)后。紫草 素屬于萘醌類物質(zhì)，是紫草中主要活性成分，又稱紫草醌或紫草寧，因具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧 化、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、傷口愈合等作用而被廣 泛報(bào)道，常用于治療結(jié)腸癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 關(guān)節(jié)炎、哮喘、急性肺損傷等。但紫草素對(duì)人骨肉 瘤的抑制活性報(bào)道較少。本研究探索紫草素通過調(diào) 控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞死亡的作用 及其機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S 分析天平（德國(guó) Sartoruis 公司）； BSC-1000ⅡA2 生物安全柜（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；HEPA Class100 型二氧化碳培養(yǎng)箱、Easy pure Ⅱ超純水儀、BiofugePrimorcentigge 型高速冷凍離 心機(jī)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司）；Accuri C6 流式 細(xì)胞儀（美國(guó) BD 公司）；SpectraMax Plus 384 酶標(biāo) 儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；Mini-Protean Tetra 電泳槽、Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽、ChemiDOC XRS+ 分子成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad 公司）；上海博迅YXQ-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）； 化學(xué)發(fā)光儀（美國(guó) Turner Designs 公司）。 

1.2 試劑

紫草素（批號(hào) S827904）購(gòu)自美國(guó) Selleck Chemicals 公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 99.03%；胎牛血清（FBS） （批號(hào) 1816937）、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自 美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司；RPMI-1640 培 養(yǎng)基（批號(hào) AAF023615）購(gòu)自美國(guó) GE 生命科學(xué)； 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）（批號(hào) 40203ES60）、細(xì) 胞凋亡試劑盒（批號(hào) 40302ES20）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；人 ATF4（ab184909）、ATF6 （ab62576）、GRP78（ab108615）、IRE1α（ab124945）、 GAPDH（ab181602）單克隆一抗、辣根過氧化物酶 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 二抗（ab6721）均購(gòu)自美國(guó) abcam 公司；干擾 RNA 訂購(gòu)于銳博生物科技有限公司； 質(zhì)粒訂購(gòu)于通用吉滿生物科技有限公司；海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（E2231）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（E2920）購(gòu)自美國(guó) Promega 公司。

1.3 細(xì)胞

人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì) 胞，將凍存管立即放入 37 ℃水浴中，輕搖使其迅 速融化，解凍后的細(xì)胞置于離心機(jī)中 1 000 r/min 離 心 5 min，吸棄凍存液，加入 1 mL 溫?zé)岬?RPMI-1640 完全培養(yǎng)基輕輕吹打，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，緩慢補(bǔ)加適 量完全培養(yǎng)基，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶形成單細(xì)胞懸液， 放入培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2 濃度、飽和濕度） 培養(yǎng)。待培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化后使用移液器吸 棄培養(yǎng)基，溫?zé)?PBS 潤(rùn)洗 2 次后加入等體積新鮮培 養(yǎng)基，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需 細(xì)胞匯合度。取匯合度為 80%～90%的生長(zhǎng)狀態(tài)良 好的細(xì)胞，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入 2 mL 溫?zé)?PBS 輕輕潤(rùn)洗 2 次，然后加入 2 mL 溫?zé)岬?0.25%胰蛋 白酶消化細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中孵育 2 min，取出放 置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞形態(tài)由貼壁狀態(tài)下 的梭形逐漸收縮變圓、間隙增大后吸棄消化液終止 消化，加入適量溫?zé)岬男迈r完全培養(yǎng)基，接著用移 液器輕輕吹打貼壁細(xì)胞，使之脫落并處于單細(xì)胞懸 浮狀態(tài)，計(jì)數(shù)后取適量細(xì)胞分置于新的無菌培養(yǎng)瓶 內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)或用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的 U-2 OS 細(xì)胞， 0.25%胰蛋白酶消化使貼壁細(xì)胞脫落，新鮮完全培104 /mL 的單細(xì)胞懸液，以 200 μL/孔的體積接種于 96 孔培養(yǎng)板中，置于 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 過夜；棄舊培養(yǎng)基，加入等體積一系列濃度梯度 （0.156 25、0.3125、0.625、0.125、0.25、0.5、1、2、 4 μmol/L）紫草素培養(yǎng)基稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后， 于每孔加入 20 μL CCK-8 溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù) 孵育 4 h，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為 490 nm 測(cè)定每個(gè)孔的吸 光度（A）值，計(jì)算不同濃度的紫草素對(duì)細(xì)胞的抑 制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，用 Graphpad Prism 5.0 軟件 計(jì)算紫草素對(duì)受試細(xì)胞株的 IC50 值。 抑制率＝（1－加藥孔平均 A 值）/空白對(duì)照孔平均 A 值

2.3 紫草素對(duì) U-2 OS 細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì)胞，棄去 培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，胰蛋白酶消化后，用新鮮 培養(yǎng)基收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以 1×105 /mL 細(xì)胞密度接 種于 6 孔培養(yǎng)板中，每孔 2 mL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 過夜待細(xì)胞貼壁，分別加入 0、1、2、4 μmol/L 紫 草素處理，繼續(xù)孵育 24 h 后，收集各孔細(xì)胞上清液， 并使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞置離心管中與 上清液合并，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清，重 復(fù)一次。往離心管中加入預(yù)先配好的 100 μL 1× Annexin V Binding Solution，制成細(xì)胞懸液，并依 次加入 Annexin V-FITC 結(jié)合物和 Propidium Iodide （PI） Solution 各 5 μL，輕彈離心管混勻試劑，室 溫下避光培養(yǎng) 15 min。最后加入 400 μL 1×Annexin V Binding Solution，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 紫草素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的調(diào)控檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì)胞，常規(guī)消化 后，用新鮮培養(yǎng)基收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，細(xì)胞以 5×105 /孔 接種于 6 孔培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。過夜待細(xì) 胞貼壁，分別加入紫草素 0、0.5、1.0、2.0 μmol/L， 繼續(xù)孵育 24 h 后，收集細(xì)胞，加入預(yù)配制的含 PMSF 和蛋白酶抑制劑混合物的 Western、IP 細(xì)胞裂解液， 制備蛋白樣品，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。制備 10% 的分離膠和 4%濃縮膠對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳分離， 轉(zhuǎn) PVDF 膜，脫脂牛奶封閉 2 h，加入相應(yīng)的一抗 （1∶1 000）4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的二抗（1∶ 10 000）常溫孵育 2 h，加入増強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液上機(jī)， 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因敲低和過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì)胞調(diào)整濃度 為 2.5×105 /mL 后接種于 6 孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中孵育過夜，75 pmol siRNA 寡核苷酸或 4、8 μg DNA 質(zhì)粒與 Lipofectamine 2000 試劑混合后轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，6 h 換液，加入 0.4、0.8、1.6 μmol/L 紫草素繼 續(xù)孵育 48 h，使用 CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。

2.6 報(bào)告基因檢測(cè)

將 ATF4 或空白質(zhì)粒（3 μg）、GRP78 報(bào)告質(zhì)粒 （3 μg）和海腎內(nèi)參質(zhì)粒（4 μg）均勻混合，用 Lipofectamine 2000 試劑對(duì)人骨肉瘤 U-2 OS 細(xì)胞進(jìn) 行轉(zhuǎn)染，6 h 換液，加入 0.8 μmol/L 紫草素繼續(xù)孵 育 24 h，使用溫?zé)岬?PBS 清洗 2 次，按說明書先檢 測(cè)螢火蟲熒光，再檢測(cè)海腎熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用各孔 海腎熒光做參比進(jìn)行校正。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處 理，計(jì)量資料采用?x±s 來表示，統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú) 立樣本 t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。

3 結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紫草素 0～4 μmol/L 作 用 24 h 能濃度相關(guān)性地誘導(dǎo) U-2 OS 細(xì)胞凋亡，凋 亡細(xì)胞比例分別為 6.30%±0.29%、11.60%±3.21%、 42.70%±8.63%、71.29%±10.75%（與 0 μmol/L 劑 量組比較）。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，紫草素能濃度相關(guān)性 抑制 U-2 OS 細(xì)胞活力，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.01）。與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染 ATF4 表達(dá)質(zhì)?？芍苯哟龠M(jìn) U-2 OS 細(xì)胞死亡，隨著 ATF4 轉(zhuǎn)染劑量的增加，細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，結(jié)果有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。將 GRP78 啟動(dòng)子序列后連接螢火蟲熒光素酶 基因，構(gòu)建 GRP78 報(bào)告質(zhì)粒，海腎熒光素酶作為參比進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染 ATF4 質(zhì)?？纱龠M(jìn) GRP78 基因的轉(zhuǎn)錄，紫草素可增強(qiáng)內(nèi) 源性或外源性 ATF4 對(duì) GRP78 基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)效 果。與第一組轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的對(duì)照組相比，差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

4 討論

青春期是骨肉瘤的發(fā)病高峰期，男性發(fā)病率高于女性，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)階段骨肉瘤的治療模式是：術(shù)前新輔助化療–手術(shù)切除–術(shù)后輔助化療?；煶Ｓ盟幬镉邪⒚顾?、甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺，通過不同組合聯(lián)合用藥。對(duì)于腫瘤 的手術(shù)切除，目前更傾向于廣泛切除而非全間室切 除，并保留重要組織，以最大程度維持肢體功能。 該模式在有效降低骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)同時(shí)還能 有效提高患者的生活質(zhì)量。除了易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移外， 骨肉瘤的治療過程還常被突如其來的化療耐藥性阻斷，因此遠(yuǎn)期生存率低于 30%。為了改善骨肉 瘤患者預(yù)后和生存率，人們從多方面尋找解決辦法，開發(fā)新的治療策略，包括根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果個(gè)體化用藥、放射治療、免疫療法和研究新的化療藥 物或耐藥逆轉(zhuǎn)劑等。

 

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