1 背景

目前，紙塑鋁復(fù)合食品包裝材料是以食品專用紙 板為基料，由聚乙烯、紙、鋁箔等復(fù)合而成的紙質(zhì)包 裝材料。因其包裝的便利性，紙塑鋁復(fù)合食品包裝材 料被廣泛應(yīng)用于液態(tài)乳制品、植物蛋白飲料、果汁飲 料、酒類產(chǎn)品以及飲用水等領(lǐng)域，但原材料中的塑料 以及印刷油墨、膠黏劑含有的重金屬殘留物通常會(huì)遷移到包裝產(chǎn)品中，對(duì)產(chǎn)品造成污染并損害消費(fèi)者 健康。此外，我國(guó)已經(jīng)研發(fā)了多種以動(dòng)植物為原料 的可食性包裝材料，并廣泛應(yīng)用于各類食品包裝。但 環(huán)境污染致使動(dòng)植物體內(nèi)積蓄鉛、砷、鎘和汞等重金 屬，這也給可食性包裝材料的應(yīng)用帶來(lái)了安全隱患。 因此，研究重金屬與生物大分子間的相互作用機(jī)理及 重金屬毒理分析，對(duì)拓展食品包裝材料的應(yīng)用領(lǐng)域至關(guān)重要。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備

1）主要試劑 木瓜蛋白酶 [EC 3.4.22.2]（生物試劑）、對(duì)氯汞 苯甲酸（化學(xué)純），美國(guó) Sigma 公司；酪蛋白，生 物試劑，上海伯樂(lè)奧生物科技有限公司；三氯乙酸、 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，化學(xué)純，上海國(guó)藥集團(tuán)化 學(xué)試劑有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。
2）主要儀器與設(shè)備 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S 型，河 南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅GZX-9246MBE 型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電子分析天平，AL204 型，梅特勒 - 托利多儀器（上海）有限公司；同步輻射紫外真空 圓 二 色（synchrotron radiation circular dichroism， SRCD）光譜儀、同步輻射裝置（Beijing synchrotron radiation facility，BSRF）、4B8 真空紫外線站（vacuum ultraviolet，VUV），中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所； 熒 光 光 譜 儀，LS-55 型， 美 國(guó) 珀 金 埃 爾 默 公 司； Materials Studio 材料模擬計(jì)算平臺(tái)，北京創(chuàng)騰科技有 限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 溶液的配制

木瓜蛋白酶和對(duì)氯汞苯甲酸用 pH=7.0 的磷酸鹽 （phosphate buffered saline，PBS）緩沖液分別配成質(zhì) 量濃度為 1 mg/mL 木瓜蛋白酶溶液和濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 溶液。 將 1 mL 的木瓜蛋白酶溶液與 1 mL CMBA 溶液 混合，放入 40 ℃集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)速為 150 r/min，攪拌 4 h，以形成均勻的混合物， 用于 SRCD 及熒光光譜測(cè)定。

2.2.2 SRCD 分析

測(cè)定參數(shù)設(shè)置如下：環(huán)境溫度 25 ℃，光徑 0.1 mm，儲(chǔ)存環(huán)的電子能量 1.5 GeV，束流強(qiáng)度 450 mA，分辨率 1.0 nm，掃描范圍 172~260 nm，停留時(shí) 間 1 min。每組樣品測(cè)定 5 次，取平均值，記錄數(shù)據(jù)。 2.2.3 熒光光譜分析 測(cè)定參數(shù)設(shè)置如下：環(huán)境溫度 25 ℃，激發(fā)波 長(zhǎng) 280 nm，激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為 5 nm，掃 描速度 500 nm/min，掃描范圍 310~400 nm。每組樣 品測(cè)定 5 次，取平均值，記錄數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)通過(guò) CDTool 軟件處理，并用 CDPRO 分析軟件計(jì)算蛋白 質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，CD 信號(hào)范圍為 -1.8×10-2 ~1.8×10-2 deg·cm2 ·dmol-1 ，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為 110 Da。

2.3 分子模擬

CMBA 與木瓜蛋白酶（papain，PaP）分子對(duì)接 操作流程按進(jìn)行。木瓜蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)來(lái) 自 Brookhaven 蛋 白 質(zhì) 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（protein data bank 編 號(hào)：1CVZ），利用 PyMOL 軟件除去木瓜蛋白酶晶 體結(jié)構(gòu)中與受體結(jié)合的原配體分子 C48 和水分子，并對(duì)受體蛋白進(jìn)行加氫加電荷處理。利用 Materials Studio 的功能模塊 Discovery 優(yōu)化對(duì)氯苯甲酸 （4-chlorobenzoic acid，PCBA）和 CMBA 的空間三 維結(jié)構(gòu)。利用 AutoDock 4.2 中 AutoGrid 和 AutoDock 兩個(gè)程序?qū)?PCBA、CMBA 與木瓜蛋白酶分子間的 相互作用進(jìn)行模擬，并對(duì)其柔性受體與剛性配體間 的對(duì)接進(jìn)行計(jì)算。對(duì)接時(shí)，受體大分子的格點(diǎn)盒子 大小為 60 nm×60 nm×60 nm，格點(diǎn)間距為 0.375 nm，盒子中心位于半胱氨酸（cysteine，Cys）25 的 巰基（—SH）上。運(yùn)用 Lamarckian 遺傳算法與局部 能量搜索相結(jié)合，利用預(yù)設(shè)配置對(duì)剛性配體分子進(jìn)行 精確對(duì)接，循環(huán)次數(shù)默認(rèn)為 10 次。每次循環(huán)運(yùn)算設(shè) 定為 100 次獨(dú)立對(duì)接實(shí)驗(yàn)，且用半經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)作為能 量打分函數(shù)，通過(guò)計(jì)算確定配體分子在受體活性口袋 中可能的結(jié)合位置，并將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行成簇聚類分 析，其均方根（root mean square，RMS）在 2.0 Å 內(nèi) 的對(duì)接結(jié)果歸為一簇。最終依據(jù)最低對(duì)接結(jié)合能和成 簇分析確定合理的木瓜蛋白酶與CMBA的結(jié)合模式， 獲得配體與受體蛋白的結(jié)合能量和對(duì)接作用模式圖， 計(jì)算氫鍵距離。

3 結(jié)果與討論

木瓜蛋白酶是一種重要的巰基蛋白，是由 212 個(gè) 氨基酸殘基組成的含 3 對(duì)二硫鍵的單鏈蛋白分子，其 一級(jí)結(jié)構(gòu)中含 7 個(gè) Cys 殘基，其中 6 個(gè)形成 3 對(duì)鏈 內(nèi)的二硫鍵，另一個(gè)Cys25則作為活性位點(diǎn)的巰基。 木瓜蛋白酶具有典型的 α+β 折疊結(jié)構(gòu)，由大小相當(dāng) 的左右 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，2 個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的裂隙為催 化活性中心，含有如下保守氨基酸殘基組成的催化 三聯(lián)體：Cys25- 組氨酸（histidine，His）159- 天冬 酰胺（asparagine，Asn）175。其中，左結(jié)構(gòu)域（L域）由 10~111 和 208~212 氨基酸殘基組成，主要是 α螺旋結(jié)構(gòu)，而右結(jié)構(gòu)域（R- 域）由 1~9 和 112~207 氨基酸殘基組成，基本是 β- 折疊結(jié)構(gòu)。SRCD 光 譜在光強(qiáng)度、偏振性和準(zhǔn)直性方面均優(yōu)于常規(guī)的圓 二色譜，尤其在 190 nm 以下短波長(zhǎng)區(qū)域，能觀察 到更多細(xì)致的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò) CDPRO 中 SELCON3, CDSSTR 和 CONTINLL 三個(gè)軟件進(jìn)行重 復(fù)擬合，確定最佳分析擬合軟件程序?yàn)?SELCON3。 SELCON3 軟件中選用的 IBasis6 算法可使實(shí)驗(yàn)值與 計(jì)算值的均方根差和標(biāo)準(zhǔn)均方根方差皆小于 0.1，適用于木瓜蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬擬合。 遠(yuǎn)紫外區(qū)（178~250 nm）是肽鍵的吸收峰

4 結(jié)語(yǔ)

利用 SRCD 和熒光光譜分析方法，結(jié)合 分子模擬技術(shù)研究了模擬生理?xiàng)l件下濃度為 1×10-4 mol/L 的 CMBA 對(duì)木瓜蛋白酶的作用機(jī)理。SRCD 和 Trp 熒光光譜分析結(jié)果表明，經(jīng) CMBA 處理前后木 瓜蛋白酶的構(gòu)象和二級(jí)結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化，一定程度 上揭示了 CMBA 作用下木瓜蛋白酶蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的 機(jī)理。利用分子模擬研究 CMBA 和木瓜蛋白酶所形 成復(fù)合物的形態(tài)，利用成簇聚類分析判定兩者間的最 佳作用模式，進(jìn)一步分析對(duì)接結(jié)果揭示了 CMBA 與 木瓜蛋白酶發(fā)生的相互作用，CMBA 與木瓜蛋白酶 活性中心 L- 域的 Gly66 和 Trp26 殘基間存在的氫鍵 和疏水作用，使 L- 域遭到破壞，導(dǎo)致 α- 螺旋結(jié)構(gòu) 含量急劇降低，β- 結(jié)構(gòu)含量增加，最終酶結(jié)構(gòu)趨向 離散，天然構(gòu)象遭到破壞，熒光猝滅，木瓜蛋白酶 失活。光譜表征分析和分子對(duì)接理論研究結(jié)果一致， 兩者相互補(bǔ)充，能夠從實(shí)驗(yàn)和理論兩方面協(xié)同研究 CMBA 分子與木瓜蛋白酶之間的相互作用，為今后 進(jìn)一步開(kāi)展重金屬與生物大分子間的相互作用機(jī)理 提供一定的理論依據(jù)和參考。



 

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