昆蟲腸道中存在多種細(xì)菌，有調(diào)控寄主生長發(fā) 育、影響寄主免疫、協(xié)助寄主消化食物等功能［１－３］。 特別對白蟻來說，其對食物中木質(zhì)纖維素的降解要 依賴于自身酶系及其體內(nèi)腸道微生物來共同完成［４］。 小菌蟲 （Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓｌａｅｖｉｇａｔｕｓ）是 世界 性 分 布 的 儲糧害蟲，我國大部分地區(qū)均有分布［５］，其 成蟲 體 長４．０～５．０ｍｍ，長橢圓形，黑褐色，有光澤，全 身密 生 黃 褐 色 短 毛， 觸 角 有 １１ 節(jié)， 棍 棒 狀， 自 第７節(jié)開始 向 內(nèi) 側(cè) 擴(kuò) 展 而 形 成 鋸 齒 狀。復(fù) 眼 較 小， 從側(cè)面看，復(fù)眼被頭部向后突出的側(cè)片所分割，其 最狹處約等于１個(gè)小眼面的寬度，鞘翅上有細(xì)毛與 刻點(diǎn)組成的縱點(diǎn)行。

１ 材料與方法

１．１ 實(shí)驗(yàn)材料

１．１．１ 供試蟲體

供試小菌蟲來源于山東第一醫(yī)科 大學(xué) （山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）病媒生物與蟲媒病實(shí)驗(yàn)室， 美洲大蠊共同飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度 （２６±１）℃、相 對濕度 （６０±１０）％、光 照１２∶１２ （Ｌ∶Ｄ），提 供 兔飼料作為食料。

１．１．２ 主要儀器和試劑

生物安全柜 （蘇州安泰空 氣技 術(shù) 有 限 公 司），ＰＣＲ 擴(kuò) 增 儀 （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ－ ｔｅｍｓ公司），水 平電 泳 槽 （北 京 君 意 東 方 電 泳 設(shè) 備 有限公 司），培 清ＪＳ－６８０Ｄ 全 自動凝膠成像分析儀 （上海培清科技有限公司），博迅YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），高精 度數(shù)顯 恒 溫 水 浴 鍋 （常州智博瑞儀器制造有限公 司），牛肉 浸 膏 （天津市英博生化試劑有限公司）， 瓊脂、酪蛋白、剛果紅、臺盼藍(lán)、細(xì)菌基因組 ＤＮＡ 提取試劑盒 （北京索萊寶科技有限公司），可溶性淀粉、溴甲酚紫 （天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），聚 乙烯醇 （ＰＶＡ）（上海源葉生物科技有限公司），羧 甲基纖維素鈉 （ＣＭＣ）（青州市清泉纖維素廠），橄 欖油 （遼寧晟麥實(shí)業(yè)股份有限公司）等。

１．２ 方法

１．２．１ 培養(yǎng)基的配置

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 （ＮＡ 培養(yǎng)基）：牛肉膏１．５ｇ，蛋白胨５．０ｇ，ＮａＣｌ２．５ｇ， 瓊脂 １０．０ｇ，加 入 ｄｄＨ２Ｏ 定 容 至 ５００ ｍＬ，調(diào) 節(jié) ｐＨ 值為７．０～７．４，１２１ ℃高 壓滅 菌２０ｍｉｎ，在 超 凈臺里均勻倒入無菌９ｃｍ 培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約４ｍｍ， 冷卻凝固后，存放于４ ℃冰箱，備用。產(chǎn)淀粉酶細(xì) 菌篩選培養(yǎng)基：在 ＮＡ 培養(yǎng)基 的 基 礎(chǔ) 上 加 入１ｇ淀 粉作為篩選 底 物，另 加０．００５％的 臺盼 藍(lán) 作 為 指 示 劑，１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ，在超凈臺里均勻倒入 無菌９ｃｍ 培 養(yǎng)皿 內(nèi)，厚 度 約４ ｍｍ，冷 卻凝 固 后， 存放于４ ℃冰 箱，備 用。產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌篩選培養(yǎng) 基：稱取羧甲基纖維素鈉５．０ｇ，硫酸銨２．０ｇ，磷酸二 氫鈉１．０ｇ，七水合硫酸鎂０．５ｇ，氯化鈉０．５ｇ，硝酸 鉀１．０ｇ，蛋白胨０．５ｇ，酵母膏０．５ｇ，０．００５％剛 果紅作 為 指 示 劑，ｄｄＨ２Ｏ 定 容至１０００ ｍＬ，調(diào) 節(jié) ｐＨ 值為７．０，１２１ ℃高壓滅菌３０ｍｉｎ，在超凈臺里 均勻倒入無菌９ｃｍ 培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約４ｍｍ，冷卻 凝固后，存放于４ ℃冰箱，備用。產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌篩 選培養(yǎng)基：稱取酪蛋白１０ｇ，瓊脂１０ｇ，加ｄｄＨ２Ｏ 定容至５００ｍＬ，用 ＮａＯＨ 調(diào)節(jié)ｐＨ 值為７．０～７．５， １２１℃高壓滅菌２０ｍｉｎ，在超凈臺里均勻倒入無菌 ９ｃｍ 培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約４ｍｍ，冷卻凝 固 后，存 放 于４ ℃冰箱，備用。產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌篩選培養(yǎng)基：在 ＮＡ 培養(yǎng)基中加入１２％橄欖油乳化液、０．００５％溴甲 酚紫，調(diào)節(jié)ｐＨ 值為８．０，１２１ ℃高壓滅菌２０ｍｉｎ， 在超凈臺里均勻倒入無菌９ｃｍ 培 養(yǎng)皿 內(nèi)，厚 度 約 ４ｍｍ，冷卻凝固后，存放于４℃冰箱，備用。橄欖 油乳化液的配制：橄欖油和０．０２ｇ／ｍＬ的聚乙烯醇 （ＰＶＡ）以體積比１∶３的比例混合，６０ Ｈｚ震蕩混 勻５～１０ｍｉｎ，得乳化液。

１．２．２ 樣品制備

取 ３ 頭小菌蟲成蟲分別置于 ２ｍＬ試 管 中，饑 餓 ２４ｈ 后，移于無菌離心管 內(nèi)， 進(jìn)行體表消毒，首先 以７５％酒 精浸 泡５ｍｉｎ，重 復(fù) ２次后，再以無 菌 水 漂 洗３次，去 除 表 面 細(xì) 菌。在 無菌的環(huán)境下，用研磨棒充分研磨蟲體，得到腸道 細(xì)菌原液。設(shè)３組重復(fù)，分別進(jìn)行涂板。

１．２．３ 小菌蟲腸道細(xì)菌的分離

取上述研磨液，分 別稀釋為１０－１、１０－３和１０－５濃度，各?。保埃?mu;Ｌ 在 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布均勻，放于培養(yǎng)箱３７℃ 培養(yǎng)２４ｈ。待 菌 生 長 后，通 過 菌 落 的 形 態(tài) 大 小 對細(xì)菌進(jìn)行分離純化，分離純化得到單個(gè)菌株，去除 重復(fù)菌株，保存?zhèn)溆谩?br />
２ 結(jié) 果

通過傳統(tǒng)分離培 養(yǎng)法，從小菌 蟲 腸 道 內(nèi) 分 離 出 ４ 種 主 要 腸 道 細(xì) 菌， 編號 Ｘｊｃ１、Ｘｊｃ２、Ｘｊｃ３和 Ｘｊｃ４。經(jīng) 細(xì)菌１６ＳｒＤＮＡ 序列 ＰＣＲ 擴(kuò) 增，電 泳 均 出 現(xiàn) 約 １５００ｂｐ 的 條 帶 ，測 序 結(jié) 果 進(jìn) 行 ＢＬＡＳＴ 比 對，并對 其 同 源 序列用 ＭＥＧＡ５．０軟 件以 Ｎ－Ｊ法 構(gòu)建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹。 結(jié)果表明 Ｘｊｃ１和 枯 草 芽 胞 桿 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） 的同源性為９９．３０％，且分類在同一支上支持率為 ９９％；Ｘｊｃ２和肺炎克雷伯菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉ－ ａｅ）的同源 性 為９８．２３％，且 分類 在 同 一 支 上 支 持 率為９９％；Ｘｊｃ３和 Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ 同源 性為９９．０９％，且分類在同一支上支持 率 為 ９０％； Ｘｊｃ４和高地芽胞桿菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）的 同 源性為 ９８．１３％ 。表 明 Ｘｊｃ１ 為 枯 草 芽 胞 桿 菌，Ｘｊｃ２ 為 克 雷 伯 菌 屬 細(xì) 菌，Ｘｊｃ３ 為 Ｐｓｅｕｄｏｃ－ ｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ，Ｘｊｃ４為芽胞桿菌屬細(xì)菌。

３ 討 論

在小菌蟲腸道中分離到４種可 培養(yǎng)細(xì) 菌，分 別 是 枯 草 芽 胞 桿 菌、肺 炎 克 雷 伯 菌、 Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆａｅｃａｌｉｓ和芽胞桿菌。其中，２種 芽胞桿菌屬細(xì)菌有產(chǎn)消化酶活性?？莶菅堪麠U菌有 產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性，芽胞桿菌僅有 產(chǎn)蛋白酶活性，但產(chǎn)酶能力低于枯草芽胞桿菌。昆蟲腸道細(xì)菌受外界環(huán) 境因素的影響，不同地域的同種昆蟲其腸道細(xì)菌的 組成結(jié)構(gòu)是存在差異的，且取食是腸道微生物變化 的主要影響因素［８－９］。本研究僅在小菌蟲的腸道中分 離出４種可培養(yǎng)細(xì)菌，可能與小菌蟲長期飼養(yǎng)于實(shí) 驗(yàn)室內(nèi)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，食料單一，是 導(dǎo)致小菌蟲的腸道細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)相對簡單的主要原 因。另外，小菌蟲一直在糧食、飼料或其他腐敗物 中孳生，腸道中可能存在大量不可培養(yǎng)的厭氧細(xì)菌。 有研究表明，同為貯藏害蟲的黑粉蟲 （Ｔｅｎｅｂｒｉｏｏｂ－ ｓｃｕｒｕｓ）腸道中僅存在金桿菌屬 （Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、 李斯特 菌 屬 （Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、微 桿菌 屬 （Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉ－ ｕｍ）、莫拉菌屬 （Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）和短小桿菌屬 （Ｃｕｒ－ ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等５個(gè)屬可培養(yǎng)細(xì)菌［１０］；同樣，黃粉 蟲 （Ｔｅｎｅｂｒｉｏｍｏｌｉｔｏｒ） 腸 道 細(xì) 菌 的 結(jié) 構(gòu) 也 比 較 簡 單，可分離到放線菌屬 （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、丙酸桿菌屬 （Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、檸檬酸桿菌屬 （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、 沙雷菌屬 （Ｓｅｒｒａｔｉａ）、芽胞桿菌屬 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、皮桿菌 屬 （Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ）、短狀桿菌屬 （Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、 棍狀桿 菌 屬 （Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）和 微小 桿 菌 屬 （Ｅｘｉｇ－ ｕｏｂｃａｃｔｅｒｉｕｍ）等９個(gè) 屬可 培 養(yǎng) 細(xì) 菌［１１］。推 測貯 藏 害蟲的腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的組成均比較單一，可能與 其遷移能力弱、食物單一有關(guān)。



 

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