草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐 富，深受消費(fèi)者的喜愛，是我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚 類，2017年產(chǎn)量高達(dá)534.56萬 t。水產(chǎn)品在貯藏、運(yùn)輸 以及銷售過程中，常常由于幾種微生物的活動而導(dǎo)致腐 敗變質(zhì)，這些微生物被稱為特定腐敗菌，是引起水產(chǎn)品 腐敗的關(guān)鍵因素。已有研究顯示氣單胞菌是冷藏草魚 的特定腐敗菌，草魚在4 ℃貯藏8 d時，氣單胞菌數(shù)量達(dá) 到8.49（lg（CFU/g）），占細(xì)菌比例的48.76%。氣單 胞菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，最低生長溫度為 0～5 ℃，可以在低溫條件下與其他嗜冷菌競爭，因此在 冷藏水產(chǎn)品中常常檢出，魚類水產(chǎn)品中氣單胞菌的污染 率達(dá)31.9%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、 Luria-Bertani（LB）肉湯、LB瓊脂、生理生化實(shí)驗(yàn)試劑盒青島海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、乙醇 國藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； N - 丁?；呓z氨酸內(nèi)酯 （N-butanoyl-L-homoserinelactone，C4-HSL）、N-己酰 基高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserinelactone，C6- HSL） 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物 技術(shù)有限公司；RP-18 F254S反相C18-薄層色譜板 德國 Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司； HY-60振蕩搖床 武漢匯誠生物科技有限公司；LDZX40II型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械公司；SWCJ-2FD 超凈工作臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV-1300 型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司； Tanon-5200凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司； KH19A高速離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離

冷藏草魚貯藏8 d（貨架期終點(diǎn)），隨機(jī)取出2 尾， 無菌條件下取腹部魚肉25 g，參照Wang Guangyu等的 方法分離氣單胞菌。挑取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板， 對單菌落進(jìn)行純化并保存。純化的菌株以W1、W2、 W3……進(jìn)行命名。

1.3.2 細(xì)菌的鑒定

利用全式金細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA， 然后擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA序列，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程 （上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行比對。 將分離的氣單胞菌屬細(xì)菌進(jìn)行氧化酶、氨基酸、糖 類利用、七葉苷等生理生化實(shí)驗(yàn)，在細(xì)菌種水平上進(jìn)一 步鑒定。

1.3.3 AHLs活性檢測

平板劃線法：將待檢測菌株與報(bào)告菌株CV026在LB平 板上平行劃線，28 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察顏色變化。 報(bào)告平板法：利用報(bào)告平板法檢測細(xì)菌生長過程中 的AHLs活性變化。過夜活化的菌株W41和W69接種于 LB肉湯，每隔4 h取10 mL菌液，12 000 r/min離心10 min 后，獲得細(xì)菌上清液，將細(xì)菌上清液經(jīng)0.22 μm微膜過濾除菌后，于－20 ℃保存?zhèn)溆?。取過夜培養(yǎng)至對數(shù)期的紫 色桿菌CV026 2～3 mL，加入冷卻至40 ℃的含1.5%瓊脂 的LB中，混勻后傾倒平板。待平板凝固后，用無菌打孔 器在瓊脂中央打孔，加入50 μL不同培養(yǎng)時間的細(xì)菌上 清，于28 ℃培養(yǎng)24～48 h，用游標(biāo)卡尺量取紫色區(qū)域直 徑，直徑越大表明AHLs濃度越高。

2 結(jié)果與分析

利用分子生物學(xué)方法，對20 株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA擴(kuò) 增，獲得的序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果 顯示均為氣單胞菌屬（Aeromonas）。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （表1）顯示，本研究分離的氣單胞菌氧化酶反應(yīng)均為陽 性，均不能利用鳥氨酸和阿拉伯糖，而均具有利用葡萄 糖產(chǎn)酸的能力，但是相同種水平的細(xì)菌在精氨酸、賴氨 酸、七葉苷、水楊苷等的利用上存在差異。Abbott等的 研究也顯示氣單胞菌屬在種水平的鑒定比較困難，傳統(tǒng) 的生理生化反應(yīng)多有重疊，很難明確區(qū)分，而且鑒定的 實(shí)驗(yàn)方法也不一致。結(jié)合16S rRNA結(jié)果，本研究分離的 氣單胞菌屬包括殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida，7?株）、 嗜水氣單胞菌（A. hydrophila，5?株）、中間氣單胞菌 （A. media，3?株）、A. rivuli（3?株）和A. molluscorum （2?株），其中嗜水氣單胞菌包含多個亞種。

利用結(jié)晶紫染色法半定量檢測氣單胞菌的生物膜 形成情況，因?yàn)槠咸烟谴龠M(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，所以在 初步檢測細(xì)菌的生物膜形成能力時，采用含有葡萄糖的 TSB肉湯進(jìn)行培養(yǎng)。參考Stepanovic等的方法，將空 白孔A590 nm值的3?倍標(biāo)準(zhǔn)差作為臨界cut-off值，根據(jù)A590 nm 值將細(xì)菌分為以下幾類：A590 nm≤0.20，弱生物膜形成能 力；0.20＜A590 nm≤0.80，中等生物膜形成能力；A590 nm＞ 0.80，強(qiáng)生物膜形成能力。

3 結(jié) 論 

檢測了冷藏草魚源分離獲得的20 株氣單胞菌 Aeromonas spp.的群體感應(yīng)現(xiàn)象和生物膜形成情況，有 18 株氣單胞菌可以產(chǎn)生AHLs信號分子，20 株菌均顯示 有不同強(qiáng)弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力 較強(qiáng)的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69為主要對 象，結(jié)果表明2 株菌的AHLs活性具有菌體密度依賴性， 該2 株菌主要產(chǎn)生C4-HSL和C6-HSL信號分子，AHLs對 細(xì)菌的生物膜形成能力影響不同，其中高濃度C6-HSL 促進(jìn)A. salmonia W41生物膜的形成；而高濃度AHLs降 低了A. salmonia W69的生物膜形成，低濃度AHLs促進(jìn) A. salmonia W69生物膜的形成。本研究顯示大多數(shù)草魚 源氣單胞菌可以產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子，并且AHLs可以 影響氣單胞菌生物膜的形成情況，為水產(chǎn)品保鮮劑的開 發(fā)提供一定的理論支持。



 

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