微小 ＲＮＡｓ （ｍｉＲＮＡｓ）是一 類 由 １８～２５ｎｔ 組成的非編碼 ＲＮＡ，可通過直接與靶基因的３′端 非翻譯區(qū) （３′－ＵＴＲ）相互作用調(diào)控靶基因的表達(dá)， 參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物過程，與包括 食管癌在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ被證實(shí)在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)，不 僅可通過靶 向 ＥＲＢＢ４、Ｉｒｆ２和 ＣＸＣＲ 參與 調(diào) 控 食 管癌的炎癥反應(yīng)，還可通過靶向 ＥＲＢＢ４誘導(dǎo)癌細(xì) 胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖；然而其 調(diào) 控 食 管 癌 細(xì) 胞增殖和凋亡的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn) 化序 列 ２ （ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ２，ＥＣＴ２）基因被證實(shí)是一種重要的致癌基因，在 乳腺癌和肺腺癌等細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

１ 材料與方法 

１．１ 細(xì)胞、主 要 試 劑 和 儀 器

 人 食 管 癌 ＥＣ－１０９ 細(xì) 胞和人正常食管上皮 ＨＥＴ－１Ａ 細(xì) 胞 （美 國 ＡＴＣＣ公司）。胎牛血清 （蘭州民海生物工程有限 公司），ＲＰＭＩ－１６４０ 培 養(yǎng) 基 （美 國 Ｇｉｂｃｏ 公 司）， 胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亞 楓、 噻 唑 藍(lán) （ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ＭＴＴ） 試 劑 （美 國 Ｓｉｇｍａ 公 司 ），ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及其 陰 性 對(duì) 照 片 段 （江 蘇 百 奧 邁 科 生 物 技 術(shù) 公 司）， 青 鏈 霉 雙 抗 混 合 液 （美 國 Ｇｅｍｉｎｉ公司），細(xì) 胞 周 期 蛋 白 Ｄ１ （ＣｙｃｌｉｎＤ１）抗 體、細(xì) 胞 周 期 蛋 白 依 賴 性 激 酶 ２ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ１，ＣＤＫ２） 抗 體、ＥＣＴ２ 抗 體、Ｂｃｌ－２ 相 關(guān) Ｘ 蛋 白 （Ｂｃｌ－２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂａｘ）抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨 酸 蛋 白 水 解 酶 ３ （Ｃｌｅａｖｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３，Ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３） 抗 體、 β肌動(dòng) 蛋 白 （β－ａｃｔｉｎ） 抗 體 （武 漢 博 士 德 生 物 公司 ）， 硝 酸 纖 維 素 膜 （ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＣ）（美國 Ｐｉｅｒｃｅ公司），辣根過氧化 酶標(biāo)記的二抗 （北京中杉金橋生物有限公司），報(bào) 告基因表達(dá) 載 體 （美 國 Ａｍｂｉｏｎ公司），二喹 啉 甲 酸 （ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）蛋白 濃 度 測(cè) 定 試 劑 盒、電 化 學(xué) 發(fā) 生 （ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， ＥＣＬ）試 劑 盒 （上 海 碧 云 天 生 物 技 術(shù) 研 究 所 ）， ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００、實(shí)時(shí)熒光定量 ＰＣＲ試劑盒、 ｃＤＮＡ 合 成 試 劑 盒 （美 國 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ）， ＴＲＩｚｏｌ總 ＲＮＡ 抽提 試 劑 盒 （北京百泰克生物公 司），雙熒 光 素 酶 檢 測(cè) 試 劑 盒 （美 國 Ｐｒｏｍｅｇａ公 司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （美國 ＢＤ 公司）。流式 細(xì)胞儀 （美 國 ＢＤ 公司），ＰＣＲ 擴(kuò)增 儀 （美 國 ＭＪ 公司），ＵＶＰ 凝膠圖象分析儀 （英國 ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ 公司），ＣＯ２ 細(xì)胞培養(yǎng)箱 （上海博迅醫(yī)療儀器有限 公司）。 

１．２ 細(xì)胞培養(yǎng)

 采用含有１０％胎牛血清和雙抗的 ＲＰＭＩ－１６４０培養(yǎng)基于體積分?jǐn)?shù)為５％ＣＯ２、溫度為 ３７℃、飽 和 濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ＥＣ－１０９ 和 ＨＥＴ－１Ａ 細(xì)胞。每隔２ｄ更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞 鋪滿瓶底 時(shí)，以０．２５％胰蛋 白 酶 消 化 傳 代。收 集 生長良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 

１．３ 細(xì)胞 分 組 和 轉(zhuǎn) 染 

將 ＥＣ－１０９細(xì)胞 分 為 空 白 對(duì)照組 （未轉(zhuǎn)染）、ｍｉＲ－ＮＣ組 （轉(zhuǎn)染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ陰 性 對(duì) 照）、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 組 （轉(zhuǎn) 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ ｍｉｍｉｃｓ）、ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組 （轉(zhuǎn) 染 ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ陰 性 對(duì) 照） 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 組 （轉(zhuǎn)染 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），每組 設(shè) ３ 個(gè) 復(fù) 孔。將 ＥＣ－１０９細(xì)胞以每孔５００μＬ （約３×１０６ 個(gè)） 接種至６孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞 貼壁生長 約 為７５％融合 時(shí)，參 照 ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００說明書步驟將配制的脂質(zhì)體 ｍｉＲＮＡ 混合物按 照實(shí)驗(yàn)分組加入到 ＥＣ－１０９細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染６ｈ后更 換含胎牛 血 清 的 新 鮮 培 養(yǎng) 基。繼 續(xù) 培 養(yǎng) ４８ｈ 后， 收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

１．４ 實(shí)時(shí)熒光定量

 ＰＣＲ 法檢測(cè) ＨＥＴ－１Ａ 細(xì)胞和 ＥＣ－１０９細(xì)胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達(dá) 水 平 收 集 未 轉(zhuǎn) 染的 ＨＥＴ－１Ａ 細(xì)胞、ＥＣ－１０９細(xì)胞和轉(zhuǎn)染４８ｈ的各 組 ＥＣ－１０９細(xì)胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ法提 取 總 ＲＮＡ，采 用分 光 光 度 計(jì) 測(cè) 定 ＲＮＡ 的濃度和完整性。參照 ｃＤＮＡ 合成試劑 盒 說 明 書 步 驟 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成ｃＤＮＡ。 以ｃＤＮＡ 為模板進(jìn)行 ＰＣＲ擴(kuò)增。２０μＬ反應(yīng)體系： ２μＬｃＤＮＡ， 加 入 １０μＬ２× 定 量 ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、各 ０．０８ μＬ 上 下 游 引 物 （摩 爾 濃 度 為２０μｍｏｌ·Ｌ－１）、０．４ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （２．５Ｕ·μＬ－１）和 ６μＬｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ 反 應(yīng) 體 系： ９５ ℃ 預(yù) 變 性 ３ ｍｉｎ，９５ ℃ 變 性３０ｓ、６０ ℃ 復(fù) 性 ３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共４０個(gè)循環(huán)。ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 引物：Ｆ５′－ＡＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧ－３′，Ｒ５′－ ＴＧＣＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ－３′； Ｕ６ 引 物： Ｆ５′－ＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴ－３′， Ｒ５′－ＧＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧ－３′。 以 Ｕ６ 為內(nèi)參，采 用 ２－△△Ｃｔ法 計(jì) 算 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ 的 相 對(duì) 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)３次。 １．５ ＭＴＴ 法 檢 測(cè) 各 組 ＥＣ－１０９ 細(xì) 胞 活 性 以 １０００ｒ·ｍｉｎ－１離心 ５ ｍｉｎ 后收 集 各 組 ＥＣ－１０９ 細(xì) 胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為２×１０４ ｍＬ－１。以每孔１００μＬ 平鋪于９６孔細(xì)胞板上，每組設(shè)３個(gè)平行孔。置于 細(xì)胞 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 常 規(guī) 培 養(yǎng)，分 別 在 培 養(yǎng) ２４、４８ 和 ７２ｈ后向每孔中加入１０μＬ ＭＴＴ （５ｇ·Ｌ－１）溶 液孵育４ｈ，并以１００μＬ二甲基亞砜溶解 ＭＴＴ 結(jié) 晶。采用酶標(biāo)儀在４５０ｎｍ 波長處檢測(cè)各組細(xì)胞的 吸光度 （Ａ）值，重復(fù)測(cè)量３次，取 Ａ 值平均值表 示各組細(xì)胞活性。

２ 結(jié) 果

食管癌 ＥＣ－１０９細(xì)胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達(dá)水平 （１．００±０．０６）明顯低于正常食管癌上皮 ＨＥＴ－１Ａ 細(xì)胞 （０．２６±０．２８） （ｔ＝４．４７６，Ｐ＝０．０１１）。與 空白 對(duì) 照 組 比 較，ｍｉＲ－ＮＣ 組 和 ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ 組 ＥＣ－１０９細(xì)胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達(dá)水平差異無統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義 （Ｐ＞０．０５）；ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細(xì) 胞中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ的表達(dá)水平較 ｍｉＲ－ＮＣ組明顯升 高 （Ｐ＜０．０５），ａｎｔｉ－ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ組 ＥＣ－１０９細(xì)胞 中 ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ表達(dá)水平較ａｎｔｉ－ｍｉＲ－ＮＣ組明顯降 低 （Ｐ＜０．０５）。見

３ 討 論

 腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中往往伴隨著某些 ｍｉＲＮＡｓ 的異 常 表 達(dá)，而 這 些 ｍｉＲＮＡｓ在 腫 瘤 細(xì) 胞 增 殖、 侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡過程中發(fā)揮重要作用；其中， 作為 ｍｉＲ－３０２ 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表，ｍｉＲ－ ３０２ｂ在多種腫瘤的進(jìn)程中扮演著重要角色。ｍｉＲ－ ３０２ｂ－３ｐ在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)，上調(diào) 其 表 達(dá) 可 通 過 靶 向 胰 島 素 樣 生 長 因 子 １ 受 體 （ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＧＦ－１Ｒ）抑制 ＡＫＴ 信 號(hào) 通 路 的 激 活，影響周期相關(guān)蛋白 ＣｙｃｌｉｎＡ２、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ６ 和 凋 亡 蛋 白 Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２的表 達(dá) 發(fā) 揮 抑 制 細(xì) 胞 增 殖、細(xì) 胞 周 期 Ｇ１→Ｓ轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)，ｍｉＲ－ ３０２ｂ 還 可 通 過 靶 向 調(diào) 控 ＥｐｈＡ２ 減 弱 Ｗｎｔ／ β－ｃａｔｅｎｉｎ／ＥＭＴ 信號(hào) 級(jí) 聯(lián) 通 路 抑 制 胃 癌 細(xì) 胞 的 增 殖、侵 襲 和 遷 移。在 惡 性 胸 膜 間 皮 瘤 細(xì) 胞 中， ｍｉＲ－３０２ｂ通過靶向 Ｍｃｌ－１抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并 誘導(dǎo)細(xì) 胞 凋 亡。肝 癌 組 織 中 ｍｉＲ－３０２ｂ 表 達(dá) 降 低，ｍｉＲ－３０２ｂ過表 達(dá) 可 通 過 直 接 靶 向 Ａｋｔ２ 減弱 ＮＦ－κＢ和 ＭＭＰ－２ 的 表 達(dá) 抑 制 癌 細(xì) 胞 的 侵 襲 和 轉(zhuǎn) 移。此外，ｍｉＲ－３０２ｂ還可 通 過 靶 向 調(diào) 控 Ｅ２Ｆ１ 增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，降 低 細(xì) 胞 活 性?？梢?，ｍｉＲ－３０２ｂ可通過調(diào)控多種靶基因或 途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問題需要我方刪除，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。