急性白血?。╝cute leukemia，AL）是常見的 血液病，在血液系統(tǒng)惡性疾病中占首位，其準確 分型對患者的治療和預(yù)后具有重大的指導(dǎo)意義。 基于形態(tài)學(xué)（包括細胞化學(xué)染色）的 FAB 分型法 是傳統(tǒng)的分型方法。隨著世界衛(wèi)生組織（WHO） 對白血病分型的提出、流式細胞術(shù)的發(fā)展，免疫 分型在臨床的應(yīng)用越發(fā)廣泛。目前，MICM 分型已 得到國內(nèi)外學(xué)者的高度認可，但仍有很多基層醫(yī) 院、甚至很大一部分三級醫(yī)院受試劑、儀器等的 限制無法普及，尤其細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)分 型，在很多醫(yī)院應(yīng)用受阻。

材料和方法 

病例一般資料 2016 年 4 月 - 2018 年 6 月在本院確診的初診急性 白血病患者 119 例。所有患者均符合白血病的診斷標準，其中 AML-M0（M0）1 例，AML-M1（M1） 4 例，AML-M2（M2）37 例，AML-M3（M3）25 例， AML-M4（M4）5 例，AML-M5（M5）10 例，AML 未分型 3 例，ALL 33 例，MAL 1 例。其中男性 65 例， 女性 54 例，中位年齡 46（3-89）歲。

儀器與試劑

 瑞氏 - 姬姆薩染色液試劑盒購自珠海貝索生物技 術(shù)有限公司，過氧化物酶（POX）染色試劑、過碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）染色試劑、醋酸萘酚酯酶（NAE） 染色試劑購自廣東西隴化工股份有限公司，由本 實驗室配制。FACSCanto II 型流式細胞儀、所有 破膜劑、溶血素及單克隆抗體，包括：HLA-DR、 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、 CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、 CD20、CD22、CD33、CD34、CD36、CD38、 CD41a、CD42b、CD56、CD58、CD61、CD64、 CD71、CD79a、CD105、CD117、CD123、GlyA、 CD45，均購自美國 Becton Dickinson 公司。細胞染 色體培養(yǎng)液、秋水仙胺購自天津瑞愛金生物科技 有限公司，ABI 7500 型 PCR 儀購自美國 Life 公司， Vilber 凝膠分析系統(tǒng)購自法國 Lourmat 公司，DY600 型中壓電泳儀購自廣東省汕頭市金砂廣播儀器 廠，博迅SSW-420-2S 型電熱恒溫水浴箱購自上海博迅 實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，淋巴細胞分離液購自 華美生物工程公司，白血病相關(guān)融合基因檢測試 劑盒購自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司。 

細胞形態(tài)學(xué)檢查 

選取骨髓小粒多、涂片好的骨髓涂片進行瑞氏 - 姬姆薩染色，油鏡下在細胞單個散在、分布均勻 的區(qū)域分類計數(shù) 200 個有核細胞，同時進行細胞 化學(xué)染色，包括過氧化物酶（POX）染色、過碘酸 - 雪夫反應(yīng)（PAS）染色、醋酸萘酚酯酶 + 氟化鈉抑 制實驗（NAE+NaF），計數(shù)陽性率并觀察酶型。 操作主要參考《全國臨床檢驗操作規(guī)程第三版》， 按 FAB 標準分型。 

免疫學(xué)分型

 采集患者肝素抗凝骨髓液 1-2 ml，24 h 內(nèi)用流 式細胞儀進行測定，按 CD45/SSC 設(shè)門分出骨髓 細胞中的幼稚細胞群和成熟細胞群；根據(jù)需要 選擇相應(yīng)系列的免疫熒光標記的單克隆抗體， 進行免疫表型檢測并分析其抗原表達情況，結(jié) 果判定以膜抗原＞ 20%，CD34 和胞質(zhì)內(nèi)抗原＞ 10% 為陽性，根據(jù)歐洲白血病免疫分類協(xié)作組（European Collaborative Group on Immunotaxonomy of Loubernix，EGIL）積分標準確定類型。 

染色體核型分析

 采集患者肝素抗凝骨髓液 2-5 ml，按 2×106 /ml 細 胞密度接種于細胞染色體培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)， 終止培養(yǎng)前 1 h 加入終濃度為 0.05 ul/ml 的秋水仙 胺，再離心收獲細胞，用甲醇和冰醋酸按 3∶1 配 置成的固定液固定 3 次，滴片，R 顯帶法進行核 型分析，每份標本盡可能分析至少 20 個中期相細 胞。核型描述參照《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體 制（ISCN2013）》。 

分子生物學(xué)檢測

 采集患者 2-3 ml 抗凝骨髓液，加入等體積生理鹽 水稀釋，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，再 裂解單個核細胞，提取總 RNA，測定 RNA 濃度。 取 20 μl 反應(yīng)體系，以試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄酶、 特異引物和模板，在 37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 1 h 得到 cDNA，以 cDNA 為模板進行多重巢式 PCR 反應(yīng)， 最后取反應(yīng)產(chǎn)物在 1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳，觀察 分析結(jié)果。 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 17.0 軟件分析，計數(shù)資料比較采用卡方 檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

119 例急性白血病中 M1 3 例，M2 27 例，M3 25 例， M4 5 例，M5 13 例，AML 未分型 10 例，ALL 32 例， AL 4 例。原始細胞及原始細胞等同細胞的形態(tài)和 細胞化學(xué)染色具有如下特征：①原始粒細胞：胞 體多數(shù)圓形或類圓形，胞漿量少、天藍色、繞于 核周，胞漿無顆?；蛞娂毿∈忍烨囝w粒，胞核圓 形或類圓形，居中或稍偏位，染色質(zhì)細顆粒網(wǎng)狀、 均勻平坦，有淡藍色核仁 1- 數(shù)個。POX 染色陽性 率≥ 3%，呈弱陽性、陽性或較強陽性，陽性反應(yīng) 物顆粒較粗大、聚集、濃縮。PAS 染色多 為弱陽性，陽性反應(yīng)物表現(xiàn)為細顆粒彌散狀。非 特異性酯酶（NAE）染色呈陰性或弱陽性，陽性 反應(yīng)物表現(xiàn)為彌散狀，不被 NaF 抑制。② M2b 細胞： 有二種類型，一種分化程度差，原始細胞胞核常 見凹陷，染色質(zhì)細致，核仁常見，核凹陷處常見“黃 沙土樣”改變，或稱“朝陽紅”, 易見 1 或 2 根細長 Auer 小體。

討　　論

 急性白血病形態(tài)學(xué)分型是結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)和細胞 化學(xué)染色特征進行分型，可對急性白血病進行亞 型診斷，迄今為止，仍是白血病診斷的基礎(chǔ)。 盧興國教授也提出，所有白血病診斷的起點是 基于外周血細胞形態(tài)學(xué)的檢驗，經(jīng)檢查和評估得 到的信息具有重要的臨床意義和價值。本研究發(fā) 現(xiàn)，某些類型的急性白血病有其典型的形態(tài)學(xué)特 征，如M3、M4EO，單純靠形態(tài)學(xué)基本可以明確診斷， 這兩種類型白血病也可以單純靠細胞遺傳學(xué)或分 子生物學(xué)直接診斷，但后者檢測時間較長，且受 儀器、試劑等的限制無法廣泛普及；本次研究還 發(fā)現(xiàn)，單純形態(tài)學(xué)分型的診斷符合率達 76.5%，接 近單純免疫學(xué)分型的診斷符合率（79.8%），兩者 間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

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