再生障礙性貧血（AA）的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜， 目前認(rèn)為其發(fā)病主要與造血干細(xì)胞（HSC）量與 質(zhì)的改變、骨髓造血微環(huán)境缺陷和免疫功能紊亂 有關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一種位于骨髓中具有自我更新、分化增殖 和多向分化潛能的干細(xì)胞。MSC 是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在造血調(diào)控中具有重要作用。

材料和方法 

病例資料 本院 2016 年 7 月 - 2017 年 2 月確診再生障礙性 貧血患者 10 例；其中 4 例男性和 6 例女性，年齡 25±10 歲；同時(shí)招募 5 名健康供者，其中 4 名男 性和 1 名女性，年齡 31±15 歲作為對(duì)照，本研究 得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署 知情同意書。 試劑與儀器 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于本醫(yī)院知情同意的再 生障礙性貧血患者及健康供者；High DMEM 基 礎(chǔ)培養(yǎng)液購自中國 Hyclone 公司；FBS 購自美國 Gibco 公司；DAPT 購自日本 Sigma 公司；CCK8 試劑盒為中國碧云天公司產(chǎn)品；AnnexinV-FITC/ PI 試劑盒為中國南京凱基生物公司產(chǎn)品；細(xì)胞 周期檢測(cè)試劑盒為中國北京嘉美生物公司產(chǎn)品； PMSF 為美國 Amresco 公司產(chǎn)品；VEGF antibody 為美國 Affinity 公司產(chǎn)品；β-actin antibody 為英 國 Abcam 公司產(chǎn)品；油紅 O 為中國生工生物公 司產(chǎn)品；TRIZOL、RNA 溶解液均為中國全式金 公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇均為中國國藥集團(tuán)化學(xué) 試劑有限公司產(chǎn)品；DEPC 為美國 Amresco 公司 產(chǎn)品；FITC 購自中國 Keygen 公司產(chǎn)品。低速離 心機(jī)購自中國上海貝恩生物科技有限公司；CO2 培養(yǎng)箱購自中國上海博訊公司；倒置顯微鏡為 日本 Olympus 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國 Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國 Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；超凝膠成像儀為美國 BioRad 公司產(chǎn)品。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的分離及鑒定 從 AA 患者收集骨髓（BM）標(biāo)本（5 ml），并從 健康供者收集正常 BM 標(biāo)本。從 AA 患者的 BM 分 離 MSC。將 5 ml 骨髓與 DMEM（1︰1） 混 合 的 BM 樣品添加到淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)液（1.077 g/ml） 上，并通過離心機(jī)分離。將骨髓單核細(xì)胞重懸于DMEM 培養(yǎng)液中，并以 1×105 /ml 的密度接種于培 養(yǎng)瓶中。在 37 ℃、5％ CO2、飽和溫度的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng) 48 h 后更換培養(yǎng)液。培養(yǎng) 3-4 d 后，細(xì)胞生 長至 80%-90% 融合，消化，傳代，依次記為第 2、 第 3…代細(xì)胞。取第 3 代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 待融合達(dá) 80%-90% 時(shí)，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 2-4 min，待 90% 左右細(xì)胞懸浮后用血清終止消化， 應(yīng)用吸管仔細(xì)吹打使之形成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液 經(jīng) 100 目的濾篩過濾。離心后棄上清，用 PBS 制 成 2×105/ml 的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分裝至 4 支 樣品管中。在 4 支樣品管中分別加入：FITC antihuman CD34、FITC anti-human CD44、FITC antihuman CD45、FITC anti-human CD90；混勻，4 ℃ 下避光反應(yīng)過夜。棄上清，每管再加入 PBS 0.5ml 重新混懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD34、CD90、CD44、CD45 的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為 5 組：①正常 MSC 組：正常人的 MSC 于 DMEM 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)；② AA 組：AA 患者的 MSC 于 DMEM 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)；③ DAPT 組： AA 患者的 MSC 于含有 10 μmol/ LDAPT 的 DMEM 完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)；④ VEGF 組：AA 患者的 MSC 于含有 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培養(yǎng)液中培 養(yǎng)；⑤ DAPT+VEGF 組：AA 患者的 MSC 于含 10 μmol/LDAPT 和 100 ng/ml VEGF 的 DMEM 完全培 養(yǎng)液中培養(yǎng)。 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8 檢測(cè)不同組中 MSC 的增 殖能力。將 MSC 接種在 96 孔板（每孔 100μl） 中并在 37 ℃下用 5％ CO2 培養(yǎng)直至完全粘附。用 DAPT 或 / 和 VEGF 處理 48 h 后，向每個(gè)孔中加入 10μl CCK8 溶液并孵育 2 h。通過酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處的光密度（OD）。 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組 MSC 的凋亡和細(xì)胞周 期。用 DAPT 或 / 和 VEGF 處理 48 h 后，用 0.25％ 胰蛋白酶消化 MSC。通過以 250 ×g 離心收集細(xì) 胞，并用冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌 2 次。然 后將這些細(xì)胞重懸于 300 μl 結(jié)合緩沖液中，并與 5 μl 膜聯(lián)蛋白 V- 熒光素異硫氰酸酯（FITC）在 室溫下黑暗中孵育 15 min。隨后在室溫下與 10 μl 碘化丙啶（PI）在黑暗中孵育 10 min，在流式細(xì)胞 儀上分析細(xì)胞凋亡。在檢測(cè)細(xì)胞周期中，將消化的 MSC 用 5 ml 70％冷乙醇在 4 ℃下固定過夜。用 冷 PBS 洗滌 2 次后，將這些細(xì)胞與 0.5 ml PI 在黑 暗中孵育 20 min，最后在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞 在細(xì)胞周期中的分布。

結(jié)　　果 

AA患者和健康供者 MSC的分離培養(yǎng) 圖1為 AA 患者骨髓 MSC 分離后 d 1 及分離培養(yǎng) 后 d 7 的圖像。圖 2 為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型細(xì)胞比例流式圖。由圖可見，正常組和 AA 組 MSC 細(xì)胞 CD34 和 CD45 均低表達(dá)。CD44 和 CD90 均高 表達(dá)，AA 組 CD44 和 CD90 表達(dá)略高于正常組，但 無顯著性差異（P ＞ 0.05）。2 者細(xì)胞群體基本一致。 細(xì)胞增殖活性 CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常 MSC 組相比，AA 組 細(xì)胞OD值降低，說明細(xì)胞增殖降低。與AA組相比， 經(jīng)過DAPT處理后，細(xì)胞OD值降低，細(xì)胞增殖降低； 經(jīng)過 VEGF 處理后，細(xì)胞 OD 值增加，細(xì)胞增殖增 加；經(jīng)過 DAPT 和 VEGF 聯(lián)合處理后，細(xì)胞增殖 高于 DAPT 單獨(dú)處理組，但低于 VEGF 處理組（圖 3）。結(jié)果提示，AA 患者細(xì)胞增殖弱于正常對(duì)照者細(xì)胞，VEGF 能改善 AA 引起的細(xì)胞增殖降低現(xiàn) 象。Notch 信號(hào)通路的抑制會(huì)加劇 AA 患者 MSC 的 增殖抑制。

討　　　論 

再生障礙性貧血（AA）是一種臨床常見的血液系 統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少，繼發(fā)貧血、 出血、感染而危及患者生命 。造血干細(xì)胞（HSC） 移植和抗胸腺細(xì)胞球蛋白聯(lián)合環(huán)孢菌素 A 和雄激 素是 AA 的主要治療策略 [2,3] 。目前研究表明，骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體 細(xì)胞 , 是一類具有自我更新能力和具有免疫調(diào)節(jié)作 用的干細(xì)胞 , 是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分 , 其通過介導(dǎo)造血干細(xì)胞黏附 , 分泌多種細(xì)胞因子和 生長因子而發(fā)揮造血支持作用。據(jù)報(bào)道，MSC 在再生障礙性貧血細(xì)胞增殖，分化和造血方面具 有重要作用 , 并發(fā)現(xiàn) CD106 在 MSC 通 過 NF-κB 在 AA 中發(fā)揮重要作用。MSC 可以通過調(diào)節(jié)幾乎 所有免疫細(xì)胞的功能來支持造血功能并維持免疫 穩(wěn)態(tài) 。同時(shí)，AA 患者 MSC 表現(xiàn)出異常的基因表 達(dá)譜和異常的免疫學(xué)特性，表明 AA 患者的 MSC 功能異常 。然而，仍需要研究 MSC 對(duì) AA 的分 子機(jī)制。

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