1 材料與方法 

1. 1 材料

1. 1. 1 細(xì)胞株

HepG2 細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株，購于中 國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1. 1. 2 藥物及試劑

苦酸通調(diào)方( 長春中醫(yī)藥大 學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供) ; 二甲雙胍( HY-17471A，MCE 公司) ; DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎 牛 血 清( 12100061、 16140071，Gibco 公司) ; 細(xì)胞裂解液、噻唑藍(lán)( MTT) 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒( P0013、C0201，武 漢碧云天生物公司) ; 棕櫚酸( MB7088，大連美侖生 物技術(shù)有限公司) ; 油紅 O 染色試劑盒、三酰甘油 ( TG) 檢測試劑盒、膽固醇檢測試劑盒( D027、A110、 A111，南京建成生物工程研究所) ; 兔抗人單克隆抗 體 AMPKα，單克隆抗體 p-AMPK( Thr172) ，單克隆 抗體乙酰輔酶 A 羥化酶( ACC) ，多克隆抗體 p-ACC ( Ser79) ( 美 國 Cell Signaling 公 司，批 號(hào) 分 別 為 5832，50081，9272，9336) ; 兔單克隆抗體 SREBP-1 ( 557036，美國 BD 公司) ; 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊 抗兔多克隆抗體免疫球蛋白( Ig) G、辣根過氧化物 酶標(biāo) 記 山 羊 抗 小 鼠 單克隆抗體 IgG ( BA1054、 BA1050，武漢博士德生物工程有限公司) ; 二喹啉甲 酸( BCA) 蛋白濃度測定試劑盒( A0216，碧云天生物 技術(shù)研究所) 。

1. 1. 3 儀器

濕化型 CO2 恒溫培養(yǎng)箱( 3111，Thermo) ; YZ-875 超凈工作臺(tái)( 江蘇蘇州凈化設(shè)備廠) ; 低溫高速離心機(jī)( 5804R，德國 Eppendorf) ; DK-S2 微 型振蕩器( 浙江金華實(shí)驗(yàn)儀器廠) ; 鼓風(fēng)干燥箱( 上海博迅醫(yī)療生物儀器公司) ; M200 PRO 酶標(biāo)儀( 瑞 士 Tecan 公司) ; 電泳儀( 美國 Bio-Rad 公司) ; 濕轉(zhuǎn) 系統(tǒng)( 美國 Bio-Rad 公司) ; 超低溫冰箱( 900，美國 Thermo Fisher) ; ECL 發(fā) 光 儀 ( 美 國 Protein Simple 公司) 。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)在 37℃，5%CO2 濕化 條 件 中，給 予 10% 胎 牛 血 清 ( FBS) 、青 霉 素 100 U/ml和鏈霉素 100 μg /ml 的低糖 DMEM 培養(yǎng) 基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度約 80%時(shí)進(jìn)行傳代。各干預(yù) 組加入無血清低糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 24 h，使 各組細(xì)胞生長同步化后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1. 3 MTT 比色法檢測細(xì)胞活力

將 MTT 溶于磷酸 鹽緩沖液( PBS) 為 5 mg /ml 過濾除菌后備用，選擇 細(xì)胞融合度約 80%的 HepG2 細(xì)胞，胰酶消化后，以 8 000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于 96 孔板。細(xì)胞貼壁生 長 24 h，吸棄原培養(yǎng)基，加入不同的干預(yù)液100 μl， 培養(yǎng) 24 h，每孔加入 MTT 溶液 10 μl，置細(xì)胞于培養(yǎng) 箱內(nèi)避光孵育 4 h。震蕩混勻，490 nm 處測定吸光 度。以對(duì)照組細(xì)胞的存活率為 100%計(jì)算不同組別 細(xì)胞存活率。

1. 4 高糖聯(lián)合棕櫚酸孵育建立

HepG2 IR 模型 稱 取 9. 165 mg 棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于 0. 25 ml 無水乙醇 中，將溶解后的棕櫚酸加入 11. 88 ml 高糖 DMEM 培 養(yǎng)〔其中含有 0. 12 ml FBS，0. 25 g 牛血清白蛋白 ( BSA) 〕，55℃ 水浴 15 min，冷卻后過濾除菌即為 3 mmol /L棕櫚酸溶液，造模時(shí)稀釋至 0. 25 mmol /L， 孵育細(xì)胞 24 h，建立 HepG2 IR 模型。

2 結(jié) 果

2. 1 對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響

與正常 組〔( 1. 00±0. 02) mmol /L〕比較，模型組細(xì)胞的葡萄 糖攝 取 量 明 顯 下 降 〔( 0. 63 ± 0. 02 ) mmol /L，P ＜ 0. 05〕; 與模型組相比，苦酸通調(diào)方高劑量組、陽性 對(duì)照 組 顯 著 增 多 HepG2 IR 細(xì)胞葡萄糖攝取量 〔( 0. 84± 0. 05) mmol /L，( 0. 93 ± 0. 02) mmol /L，P ＜ 0. 05〕，且增加細(xì)胞葡萄糖攝取量的效果呈劑量依 賴性?？嗨嵬ㄕ{(diào)方低、中劑量組攝取量為〔( 0. 66± 0. 03) mmol /L，( 0. 72±0. 03) mmol /L〕與模型組無差 異( P＞0. 05) 。

2. 2 油紅

O 染色 造模液作用后細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯 增多，隨著苦酸通調(diào)方濃度的增加，細(xì)胞脂滴逐漸減 少。見圖 1。

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為 T2DM 屬“消渴”“脾癉”范疇，苦酸通 調(diào)方依據(jù)六郁和絡(luò)滯病機(jī)，確立“苦酸制甜”、“辛開 苦降”、“活血通絡(luò)”、“解毒通絡(luò)”為基本治法，選用 丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、 生地、酒大黃組成本方。諸藥辛苦酸并用，寒溫相 佐，達(dá)到了苦酸制甜，辛開苦降，通達(dá)絡(luò)脈之功。

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