1 材料和方法 

1.1 設(shè)計(jì) 

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。 

1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 

實(shí)驗(yàn)于2017年9月至2018年9月在廣西 醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室完成。 

1.3 材料 

1.3.1 動(dòng)物 

清潔級(jí)新生24 h內(nèi)的雄性SD大鼠2只，由廣 西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK 桂 2014-0002。實(shí)驗(yàn)于2017年10月經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)201710008。 

1.3.2 主要試劑 

原兒茶酸(純度≥98%，白色結(jié)晶粉末)、 100×青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、蘇木精-伊紅染色 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng) 基購(gòu)自Gibeo公司；黃綠素、MTT、碘化丙啶(PI)購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；Ⅱ型膠原一抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)自博士 德公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PBS購(gòu)自邁新 公司購(gòu)；番紅染色試劑盒購(gòu)自基爾頓生物科技(上海)有限 公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司。 

1.3.3 主要儀器 

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾 科技(中國(guó))有限公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司； 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Themo公司；超 凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司。 

1.4 方法 

1.4.1 軟骨細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 

將2只乳鼠拉頸處死，浸泡 于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒15 min后，無(wú)菌條件下切除兩側(cè) 股骨，用眼科剪將股骨兩端軟骨剪下，用含青鏈霉素雙抗液 的PBS沖洗數(shù)次；將軟骨組織剪碎至約1 mm3 大小，轉(zhuǎn)移到 15 mL離心管中加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，棄上清液， PBS清洗3次，加入2 g/L的Ⅱ型膠原酶并置入體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中消化3.0-4.0 h。200目不銹鋼篩網(wǎng) 過(guò)濾后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng) 基，用吸管反復(fù)吹打重懸細(xì)胞，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，于 37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換培養(yǎng)液除 去未貼壁細(xì)胞，之后每3 d換液，細(xì)胞融合后用0.25%胰酶消 化3-5 min，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基終止消 化，按1∶3的比例傳代。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

1.4.2 細(xì)胞毒性測(cè)定 

以MTT法測(cè)量原兒茶酸對(duì)關(guān)節(jié)軟骨 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。將細(xì)胞按2 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng) 板中，8 h后更換含有不同濃度原兒茶酸(1-150 mg/L)的 DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 每孔加 20 mL MTT(5 g/L)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h；去培養(yǎng) 基，每孔加150 μL DMSO，孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處的吸光度值。

1.4.3 細(xì)胞分組與干預(yù) 

第3代軟骨細(xì)胞分為5組：空白 組、模型組、原兒茶酸低劑量(10 mg/L)組、原兒茶酸中劑 量(30 mg/L)組、原兒茶酸高劑量(50 mg/L)組，每組設(shè)置3 個(gè)副孔。其中空白組僅加入培養(yǎng)液；模型組加入含10 mg/L 的白細(xì)胞介素1β的培養(yǎng)液；原兒茶酸低、中、高劑量組加 入含10 mg/L白細(xì)胞介素1β的培養(yǎng)液以及10，30，50 mg/L 原兒茶酸。干預(yù)時(shí)間為24 h。

2 結(jié)果 

2.1 原兒茶酸對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖抑制作用 

MTT檢測(cè) 結(jié)果顯示，在10-50 mg/L的濃度范圍內(nèi)，原兒茶酸能夠明 顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，其中30 mg/L原兒茶酸的生長(zhǎng)刺激 作用最強(qiáng)。大于50 mg/L的原兒茶酸可明顯抑制軟骨細(xì)胞的 增殖，見(jiàn)圖1，因此實(shí)驗(yàn)選擇10，30，50 mg/L作為后續(xù)實(shí) 驗(yàn)研究的有效濃度。 

2.2 原兒茶酸對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞 DNA 含 量 的 影 響 

Hoechst 33258結(jié)果顯示，原兒茶酸中劑量組DNA含量接 近于空白組，原兒茶酸低劑量組和原兒茶酸高劑量組DNA 含量較原兒茶酸劑量組低，說(shuō)明30 mg/L原兒茶酸能更有效 保護(hù)軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖2。

3 討論 

隨著社會(huì)老齡化程度的進(jìn)展，退行性骨關(guān)節(jié)炎病患越 來(lái)越多。骨性關(guān)節(jié)炎一般以疼痛、腫脹等臨床癥狀多見(jiàn)， 給患者帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。關(guān)節(jié)軟骨由于缺 乏神經(jīng)血管等組織，導(dǎo)致其再生能力較差。已有研究表明 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是維持軟骨基質(zhì)的合成和分解代謝的惟一細(xì)胞類型并證明了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要原因。

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