冠心病( CHD) 是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣 硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、 缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病。臨床上主要有藥 物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移 植術(shù); 但是在恢復(fù)心肌血流的同時，由于氧自由基大 量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌凋亡通路激活，可能會加重心肌細(xì) 胞結(jié)構(gòu) 及 功 能 的 損 傷，即 心 肌 缺 血/再 灌 注 損 傷 ( MI /ＲI) 。MI /ＲI 降低了缺血性心臟病的治療效 果，增加了患者負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的方法防治 MI /ＲI 成為亟待解決的問題。

1 材料

1. 1 細(xì)胞

大鼠子一代 H9c2 心肌細(xì)胞，購于上海子實生物科技有限公司。

1. 2 藥物與試劑

瓜蔞皮藥材收集于河北省安國 市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒 定為葫蘆科植物栝樓的干燥成熟果皮; Na2 S2O4 ( 美 國百靈威科技有限公司，純 度 85% ) ; NO，eNOS， iNOS 酶聯(lián)免疫吸附測定( ELISA) 試劑盒( 上海聯(lián)碩 科技有限公司，批號均為 201804) ; 兔抗大鼠 Akt，磷 酸化( p) -Akt( Ser 473) ，eNOS，iNOS，甘油醛-3-磷酸 脫 氫 酶 ( GAPDH ) 抗 體 ( 美 國 Cell SignalingTechnology 公司，批號均為 BC18AA0047) ; 辣根過氧 化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白( Ig) G 二抗，牛血 清白蛋白( BSA) ( 上海碧云天生物技術(shù)有限公司， 批號分 別 為 B0802，P2300 ) ; 噻唑 藍(lán) ( MTT) ，SDSPAGE 凝膠制備試劑盒( 北京索萊寶科技有限公司， 批號分別為 CA1020，P1200) ; 二甲基亞砜( DMSO， 美國 Sigma 公司，批號 201806270285) ; DMEM 高糖 培養(yǎng)基，胎牛血清( FBS) ，0. 25% 胰蛋白酶( 美國 Gibco 公司，批號均為 G18032) ; 1% 青霉素-鏈霉素 雙抗、磷酸鹽緩沖液( PBS) ( 美國 Hyclone 公司，批 號分 別 為 J180012，J170035 ) ; 細(xì)胞 裂 解 液，EZ-10 DNAaway ＲNA 小量提取試劑盒，PCＲ 引物，動物全 蛋白提取試劑盒［生工生物工程( 上海) 股份有限公 司，批 號 分 別 為 D612002，B518651，B662204， 600530-53］; ProtoScript  Ⅱ 反轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 ( 美 國 NEB 公司，批號 0041509) ; 聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜 ( 美國 Merck Millipore 公司，批號 421302) ; BCA 蛋 白濃度測定試劑盒，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒( 上海碧 云天生物技術(shù)有限公司，批 號 分 別 為 P0007， N1410) ; 實驗用水為超純水。

1. 3 儀器

Thermo HEＲAcell 150i 型 CO2 細(xì)胞培 養(yǎng)箱，NanoDrop 2000 型超微量分光光度計( 美國 Thermo Scientific 公司) ; MＲ18. 22 型超速低溫離心 機(jī)( 法國 Jouan 公司) ; CP225D 型微量電子天平( 德 國 Sartorius 公司) ; Infinite M200 型多功能酶標(biāo)儀 ( 瑞士 Tecan 公司) ; BD FACSVerse 型流式細(xì)胞儀 ( 美國 BD 公司) ; Stratagene Mx 3000P 型實時熒光 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( Ｒeal-time PCＲ) 儀 ( 美 國 Agilent 公司) ; JY200C 型電泳儀( 北京君意電泳設(shè) 備有限公司) ; Tanon-5200 型凝膠成像系統(tǒng)( 上海天 能科技有限公司) 。

2 方法

2. 1 藥物制備及溶液配制

稱取干燥的瓜蔞皮粉 末 100. 0 g，加入蒸餾水 1 000 mL 浸泡 30 min，煎煮 2 h，8 層紗布過濾。濾渣重復(fù)提取 2 次，合并濾 液，減壓濃縮至 100 mL，再經(jīng)真空冷凍干燥，即得樣 品( 得率為 19. 5% ) ，于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?精密稱取干燥的瓜蔞皮水提物 20. 0 mg，溶于 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，配制成 2. 0 g·L － 1的儲存液， 0. 22 μm 濾器過濾除菌，置于 4 ℃ 冰箱備用。根 據(jù)后續(xù)的實驗需求，以 DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋成相 應(yīng)終質(zhì)量濃度( 50 mg·L － 1 ) 。 精密 稱 取 Na2 S2O4 30. 72 mg，溶于 PBS 溶 液 15. 0 mL 中，配成 10 mmol·L － 1 Na2 S2O4 儲備液，再用 PBS 稀釋成規(guī)定濃度，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 2 細(xì)胞培養(yǎng)

取 H9c2 心肌細(xì)胞，用含 10% FBS， 1% 雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基( 以下簡稱培養(yǎng)液) 于 37 ℃ 5% CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)( 以下培養(yǎng)條件 相同) ，適時換液。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到 80% 以上時， 即可進(jìn)行傳代。傳代至第 5 代時，取對數(shù)生長期細(xì) 胞進(jìn)行實驗。在每次實驗前，吸棄各培養(yǎng)瓶中的培 養(yǎng)液，換 0. 5% FBS 的培養(yǎng)液“饑餓”12 h，進(jìn)行心肌 細(xì)胞同步化處理。

2. 3 細(xì)胞造模、分組及給藥

根據(jù)文獻(xiàn)報道及前期 實驗工作，心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型按照 2. 2 項下方法培養(yǎng)細(xì)胞。將培養(yǎng)液吸出，用 PBS 洗滌對 數(shù)生 長 期 細(xì) 胞 1 ～ 2 次 后 換 上 2. 5 mmol·L － 1 Na2 S2O4 溶液，置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空氣細(xì)胞培 養(yǎng)箱內(nèi) 30 min，造成細(xì)胞缺氧; 再將缺氧培養(yǎng)基換成 培養(yǎng)液置于 37 ℃ 5% CO2 95% 空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi) 4 h，使細(xì)胞復(fù)氧。 根據(jù)前期瓜蔞皮提取物給藥劑量的篩選及預(yù)實驗，按照 2. 2 項下方法培養(yǎng)細(xì)胞，隨機(jī)分為正常 組: 正常培養(yǎng)，不進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理; 模型組( H /Ｒ 組) : 細(xì)胞缺氧 30 min，復(fù)氧 4 h; 瓜蔞皮提取物組 ( 50 mg·L － 1 ) : 藥物 預(yù) 孵 育 24 h，然 后 造 成 缺 氧 30 min，復(fù) 氧 4 h; 抑 制 劑 組 ( LY294002， 10 μmol·L － 1 ) : 抑制劑與瓜蔞 皮提取物 ( 50 mg·L － 1 ) 共 同 預(yù) 孵 育 24 h，然 后 造 成 缺 氧 30 min，復(fù)氧 4 h。

2. 4 各組細(xì)胞活力的檢測

按照 2. 2 項下方法培養(yǎng) 細(xì)胞。取對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞，以 1 × 105 個/mL 的密度接種于 96 孔板，每孔 100 μL，按照 2. 3 項下 方法進(jìn)行隨機(jī)分組、給藥預(yù)處理及造模。復(fù)氧后，根 據(jù) MTT 說明書，處理結(jié)束后的各組細(xì)胞每孔加入 MTT 溶液( 5 g·L － 1 ) 20 μL，避光孵育 4 h; 吸去培養(yǎng) 液，加入 DMSO 150 μL 渦旋振蕩 10 min，使結(jié)晶充 分溶解; 用酶標(biāo)儀在 570 nm 波長處測定吸光度 A。 另設(shè)空白組，加入相應(yīng)量培養(yǎng)液和 MTT，DMSO 試劑 但不加入細(xì)胞。每種處理設(shè) 6 個復(fù)孔，實驗重復(fù) 3 次。根據(jù)以下公式計算存活率。 細(xì)胞存活率 = ( A1 － A0 ) /( A2 － A0 ) × 100% 式中 A1 是實驗組的吸光度; A2 是正常組的吸 光度; A0 是空白組吸光度。

2. 5 ELISA 檢測

各 組 細(xì) 胞 NO 釋 放 量 及 eNOS， iNOS 活 性 水 平 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以 1 × 105 個/mL的密度接種于 24 孔板，每孔 0. 5 mL。按 照 2. 3 項下方法進(jìn)行隨機(jī)分組、給藥預(yù)處理及造模。復(fù)氧后，取各組心肌細(xì)胞上清液按試劑盒說明書檢 測 NO 釋放量; 預(yù)冷 PBS 洗滌細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解 液，30 min 后收集細(xì)胞裂解液，按試劑盒說明書檢測 eNOS，iNOS 的活性水平。

3 結(jié)果

與正 常組比較，心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧后，細(xì)胞存活率顯 著降低( P ＜ 0. 01) ，表明缺氧/復(fù)氧模型復(fù)制成功。 50 mg·L － 1瓜蔞皮提取物單獨預(yù)處理后，與模型組比 較，細(xì)胞存活率升高; 與 50 mg·L － 1瓜蔞皮提取物組 比較，PI3K 特異性抑制劑 LY294002 預(yù)處理后抑制 了細(xì)胞活性( P ＜ 0. 01) 。與正常組比較，模型組細(xì)胞中 NO 釋放量， eNOS 水平均顯著降低( P ＜ 0. 01) ; 與模型組比較， 50 mg·L － 1瓜蔞皮提取物單獨預(yù)處理 24 h 后，NO 含 量，eNOS 水 平 顯 著 升 高 ( P ＜ 0. 01) ; 抑 制 劑 LY294002 預(yù)處理后，在相同濃度的瓜蔞皮水提物預(yù) 處理條件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( － ) 組之 間比較，NO 含量和 eNOS 活性水平均明顯降低( P ＜ 0. 05) ; 而各組細(xì)胞 iNOS 的活性水平與 eNOS 的變 化趨勢相反。與正常組比較，模型組細(xì)胞 中 Akt，p-Akt，eNOS 的蛋白表達(dá)水平顯著降低， p-Akt /Akt 顯 著 降 低 ( P ＜ 0. 01 ) ; 與模 型 組 比 較， 50 mg·L － 1瓜蔞皮提取物單獨預(yù)處理 24 h 后，Akt， p-Akt，eNOS 的蛋白表達(dá)水平都升高，p-Akt /Akt 顯 著上升( P ＜ 0. 01) ; 抑制劑 LY294002 預(yù)處理后，在 相同濃度的瓜蔞皮水提物預(yù)處理條件下 LY294002 ( + ) 和 LY294002 ( － ) 組 之 間 相 比，Akt，p-Akt， eNOS 的蛋白表達(dá)水平均降低，p-Akt /Akt 下降( P ＜ 0. 01) ; 而各組細(xì)胞 iNOS 的蛋白表達(dá)水平與 eNOS 的變化趨勢相反。

4 討論

心肌缺血、缺氧可導(dǎo)致心肌代謝功能異常和結(jié) 構(gòu)破壞，從而引發(fā)胸痛或胸部不適，屬中醫(yī)“胸痹” “真心痛”的范疇。臨床上主要采用藥物治療 法、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移植術(shù) 等治療心肌缺血; 但是在心肌血流恢復(fù)的同時，由于 氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌凋亡通路激活，可能會 加重心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷，即心肌缺血再灌 注損傷( MI /ＲI) 。由于誘發(fā) MI /ＲI 的原因較為復(fù)雜，涉及到氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣超載和能量代 謝等，目前尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的治療方法。因 此，尋找有效的藥物來預(yù)防和治療心肌缺血性疾病 對于臨床實踐有著重要的意義。