阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一 種革蘭氏陰性致病菌，常污染乳及乳制品，可引起 嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、 壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血 癥，死亡率高達(dá) 50%以上。 即使治愈，也可能使 神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生后遺癥。 近幾年，隨著國內(nèi)外一系 列與阪崎克羅諾桿菌相關(guān)的污染事件的爆發(fā)，該 菌受到研究者的廣泛關(guān)注。 目前，對阪崎克羅諾 桿菌確切的污染來源尚不清楚， 許多病例表明嬰 幼兒配方乳粉是該菌的主要感染載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC BAA-894 由中國食品藥品檢定研究院提供，分離 于嬰幼兒配方乳粉和米粉中不同基因型的阪崎克 羅諾桿菌 11-19 （1）、12-4 （1）、12-8 （1）、12-13 （2）、13-8（2）、13-2（1）、14-20（1）、14-15（2）、14-4 （1）、15-9（2）、18-16（1）、18-8（1）、18-24（1）、18- 12（2）和 18-14（1）由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué) 與工程學(xué)院微生物研究室提供。 供試代表性菌株 選擇標(biāo)準(zhǔn)： 分離于不同時間采集的不同品牌的嬰 幼兒乳粉或米粉， 具有不同耐藥表型和基于脈沖 場 凝 膠 電 泳 （Pulsed field gel electrophoresis， PFGE）的基因型，攜帶不同毒力基因。 產(chǎn)乳酸菌素 乳酸菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呂欣博士惠贈。

1.1.2 材料與試劑

LB 瓊脂培養(yǎng)基、LB 肉 湯 培 養(yǎng)基、MH 瓊脂培養(yǎng)基（MHA）和腦心浸液培養(yǎng)基 （BHI），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；媽咪愛， 購自北京韓美藥品有限公司； 制作菌懸液用嬰幼 兒配方乳粉，購于陜西楊陵好又多超市，為適于較 大嬰兒及幼兒食用的 2 段配方牛乳粉。

1.1.3 主要儀器

高壓滅菌鍋 （LAC-5080S），上海博訊；超凈工作臺（SW-CJ-1CU），蘇州泰安；微 量移液槍（Effendorf），德國；百分之一天平（XS204）， 梅特勒；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-211B），上海智 誠。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和擴(kuò)大培養(yǎng)

用接種環(huán)分別蘸取 少量保存于-80 ℃ LB 肉湯/甘油（50%/50% V/V） 中的阪崎克羅諾標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株， 劃線接種到 LB 瓊脂培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng) 18～24 h。 從 LB 培 養(yǎng)基上挑取一個單菌落， 接種到 20 mL BHI 肉湯 中，37 ℃、100 r/min 下?lián)u床培養(yǎng) 10 h。

1.2.2 菌液初始濃度測定和存活率計算

取 1 mL 阪崎克羅諾桿菌 BHI 肉湯培養(yǎng)物，用生理鹽水 依 次 進(jìn) 行 10 倍 稀 釋， 分 別 得 到 其 101 ，102 ，103 ， 104 ，105 和 106 倍稀釋液。 分別取各稀釋液 50 μL 接種于 LB 平板上， 涂布均勻后 37 ℃下倒置培養(yǎng) 18 h， 計數(shù)。 同時接種 50 μL 無菌生理鹽水于 LB 平板表面作為陰性對照。 每個稀釋度（包括對照） 共做 3 個重復(fù)。 選擇菌落分布均勻且皿內(nèi)菌落數(shù) 在 30～300 CFU 的稀釋度的菌落數(shù)計算菌液的起 始濃度。

1.2.3 阪崎克羅諾桿菌對溫度的耐受性測定

結(jié)合日常生活中乳粉沖調(diào)時使用的水溫， 分別選取 50，60 和 70 ℃ 3 個溫度點(diǎn)進(jìn)行研究。 取 1.2.1 節(jié) 中的 BHI 肉湯培養(yǎng)物 1 mL 加入到滅菌的裝有 10 mL 沖調(diào)乳粉（用礦泉水按照乳粉生產(chǎn)商的推薦比 例沖調(diào)，下同）的 50 mL 離心管中，振蕩混勻，將離 心管分別置于 50，60 和 70 ℃的水浴中保溫處理 20 min，保溫過程不斷進(jìn)行振蕩使菌體受熱均勻。 處理結(jié)束后，按照 1.2.2 節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計算存活率， 采用存 活率衡量其對溫度的耐受性。

1.2.4 阪崎克羅諾桿菌對 pH 的耐受性測定

將 沖調(diào)好的乳粉高溫滅菌后， 使用無菌 HCl 和/或 NaOH 調(diào)整其 pH 為 4.0，6.0 和 8.0， 確定每個離 心管中調(diào)整 pH 值后的乳粉體積為 20 mL 后，分 別向其中 加 入 1 mL 1.2.1 節(jié) 中 的 BHI 肉 湯 培 養(yǎng) 物，振蕩勻后室溫下靜置 20 min。 處理結(jié)束后，按 照 1.2.2 節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿 菌的濃度并計算存活率，采用存活率衡量其對 pH 的耐受性。

2 結(jié)果與分析

阪崎克羅諾桿菌經(jīng) 50，60 和 70 ℃處理后的 存活率見表 1。 50 ℃處理后，除 12-8（1）和 14-15 （2）死亡較多外，其它菌株基本沒有死亡，大部分 菌株反而呈生長態(tài)勢。 當(dāng)溫度上升到 60 ℃時，所 有菌株都呈現(xiàn)出死亡的趨勢。70 ℃時，所有菌株的 存活率都低于 0.11%。 對 3 種溫度處理后阪崎克 羅諾桿菌濃度的對數(shù)值方差分析和多重比較結(jié)果表明：50，60 與供試菌株在 pH 4.0，6.0 和 8.0 條件下處理后 的存活率。 3 種 pH 條件處理后，大部分菌 株出現(xiàn)不同程度死亡。 13-2（1）的死亡率均相對較 高，說明該菌對 pH 比較敏感。 18-8（1）、18-16（1） 和 18-12（2）經(jīng) pH 處理后還出現(xiàn)增長態(tài)勢，表明對 pH 的耐受性非常強(qiáng)。阪崎克羅諾桿菌經(jīng) 3 種 pH 處理后存活率方 差分析和多重比較結(jié)果表明：pH 4.0 條件處理與 pH 6.0 和 pH 8.0 條件處理后菌液濃 度的對數(shù)值在 1%水平上存在極顯著差異。 pH 6.0 與 pH 8.0 條件處理后菌株存活率無顯著性差異。菌株 12-4（1）對乳酸菌最敏 感，而 14-4（1）和 15-9（2）的耐受性較強(qiáng)，表明產(chǎn) 乳酸菌素的乳酸菌對阪崎克羅諾桿菌生長具有一 定的抑制， 多重比較結(jié)果表明不同菌株對乳酸菌 的敏感性具有極顯著的差異。

3 討論

阪崎克羅諾桿菌是一種常見的食源性條件致病菌，在嬰幼兒乳粉、米粉、奶酪、面包及豆腐等多 種食品中均被檢出。 自 Muytjens 等于 1983 年 從沖調(diào)乳粉的器具上分離到阪崎克羅諾桿菌，繼 而將其與嬰幼兒乳粉聯(lián)系起來后，世界多地，如： 美國、丹麥、冰島和新西蘭等，均出現(xiàn)了由阪崎克 羅諾桿菌引起的疾病暴發(fā)。 2011 年，在美國俄克 拉馬州和密蘇里州相繼發(fā)生了嬰兒感染阪崎克羅 諾桿菌致死的事件，之后，美國的沃爾瑪超市及一 些零售商開始大規(guī)模召回嬰幼兒乳粉。 這些事 件的爆發(fā)表明研究與乳粉密切相關(guān)的阪崎克羅諾 桿菌具有十分重要的意義。