大腦短暫缺血性損傷或再通可見(jiàn)于頭頸部手術(shù)出現(xiàn)的 并發(fā)癥，腦血栓形成后部分腦血管的自然再通或者藥物溶 栓再通也會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注損傷 時(shí)，大腦缺血邊緣區(qū)( 半暗區(qū)) 細(xì)胞以凋亡為主要死亡方式， 及時(shí)的藥物干預(yù)可以抑制細(xì)胞凋亡，因此該區(qū)域?yàn)槟X缺血 以及再通后重點(diǎn)搶救區(qū)域。而海馬區(qū)對(duì)缺血缺氧相當(dāng)敏 感，及時(shí)搶救海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡，對(duì)保護(hù)海馬區(qū)的記憶、 學(xué)習(xí)功能有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康 6 周齡雌性昆明種小鼠 33 只，體質(zhì) 量 22 ～ 30g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許 可證號(hào): SCXK( 粵) 2013 － 0034。自由飲食飲水飼養(yǎng)，自然光 暗周期。

1. 2 藥物與試劑

三七總皂苷，云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有 限 公 司 提 供，規(guī) 格: 200mg /支，批 準(zhǔn) 文 號(hào): 國(guó) 藥 準(zhǔn) 字 Z20026437; 兔抗小鼠 Bax 和 Bcl － 2 多克隆抗體，CST 公司 提供; SABC 免疫組化染色試劑盒，規(guī)格: 1kit，購(gòu)自武漢博士 德生物試劑公司; DAB 顯色試劑盒( 20 × ) ，規(guī)格: 3ml，購(gòu)自 北京索萊寶科技有限公司。

1. 3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡( 日本 OLYMPUS 公司) ; 冰凍 切片機(jī)( 德國(guó) LEICA 公司) ; 博迅SSW-600-2S電熱恒溫水槽( 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司) 。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 動(dòng)物分組

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白組( 7 只) 、PNS 組( 8 只) 、缺血 9d 組( 9 只) 、缺血 24h 組( 9 只) 。

2. 2 模型制備

PNS 組、缺血 9d 組和缺血 24h 組參照相關(guān)中的方法改進(jìn)制備缺血再灌注模型。稱小鼠體質(zhì)量， 腹腔注射水合氯醛( 0. 003ml /g) 麻醉小鼠，待小鼠無(wú)翻正反射 后，固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸部切開(kāi) 0. 8 ～ 1cm 正中切 口，剪毛，切開(kāi)皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，暴露頸動(dòng)脈 鞘，然后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)約 0. 5 ～ 1cm，并用絲 線穿過(guò)頸總動(dòng)脈下方，提拉絲線，以動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈阻斷 血流 20min，然后去除，恢復(fù)灌注，最后縫合皮膚，消毒。

2. 3 給藥方法

PNS 組于缺血前 3d 開(kāi)始腹腔注射 PNS 30mg /( kg·d) ，之后每天同一時(shí)間注射等體積 PNS，持續(xù) 至再灌注第 9 天后取腦。缺血 9d 組和缺血 24h 組均在造模 前 3d 以等體積的 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射，之后每天 同一時(shí)間等體積注射 0. 9% 氯化鈉注射液，分別持續(xù)注射至 再灌注第 9 天和再灌注 24h 后取腦?？瞻捉M在缺血 9d 組造 模前 3d 以等體積 0. 9% 氯化鈉注射液腹腔注射，之后每天 同一時(shí)間注射等體積 0. 9% 氯化鈉注射液，持續(xù)注射至第 9 天后取腦。

2. 4 觀察指標(biāo)

SABC 免疫組化方法: 獲得鼠腦后按冰凍 切片制作方法進(jìn)行切片，厚度 30μm。按照 SA1020 － 小鼠/ 兔 IgG SABC 免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，步驟 為消除組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、抗原修復(fù)、封閉、孵育一抗、 孵育二抗、孵育 SABC、DAB 顯色、脫水、透明、封片。其中每 組腦片分別進(jìn)行 2 次免疫組化染色，分別孵育 Bax 抗體( 工 作濃度 1∶ 800) 和 BCL － 2 抗體( 工作濃度 1∶ 1600) 。其中， DAB 顯色法步驟按照 DAB 顯色試劑盒( 20 × ) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 具體步驟: 將工作 A 液、B 液、PBS 液按 50∶ 50∶ 900 稀釋并混 合，室溫避光孵育切片 30min，在顯微鏡下觀察顯色，用蒸餾 水洗滌終止反應(yīng)。 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù): 在 200 倍光學(xué)顯微鏡下在腦組織切片的 海馬區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取 5 個(gè)視野計(jì)數(shù)免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞 數(shù)。并分別記錄每組切片 Bax 和 Bcl － 2 免疫組化染色陽(yáng)性 的細(xì)胞數(shù)。

2. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，2 組 間比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 表示。P ＜ 0. 05 表示差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠海馬區(qū) Bax、Bcl － 2 表達(dá)水平比較: 與空白組比 較，缺血 9d 組 Bcl － 2、Bax 水平均明顯增高; 與缺血 9d 組比 較，PNS 組 Bax 的表達(dá)水平明顯降低，Bcl － 2 /Bax 的表達(dá)水平 明顯增高; 缺血9d 組 Bax 和 Bcl － 2 的表達(dá)均較缺血24h 組增 高; 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。( 見(jiàn)圖 1、圖 2) 表 1 各組小鼠海馬區(qū) Bax、Bcl － 2 水平比較( x ± s，個(gè)) 組別 只數(shù) Bcl － 2 Bax Bcl － 2 /Bax 空白組 7 2. 94 ± 2. 15 4. 00 ± 4. 10 0. 92 ± 0. 52 PNS 組 8 7. 30 ± 3. 75 3. 35 ± 1. 81 2. 26 ± 0. 70cd 缺血 9d 組 9 27. 44 ± 19. 59abd 63. 44 ± 12. 77abd 0. 46 ± 0. 32 缺血 24h 組 9 0. 58 ± 0. 88 1. 58 ± 1. 44 0. 61 ± 1. 11 注: 與空白組比較，a P ＜ 0. 05; 與 PNS 組比較，b P ＜ 0. 05; 與缺血9d 組比較，c P ＜0. 05; 與缺血24h 組比較，c P ＜0. 05。


4 討 論

PNS 具有廣泛的藥理作用，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其不僅能抑制 炎癥因子、清除自由基、抗氧化應(yīng)激，還能通過(guò)活血化瘀、擴(kuò) 張毛細(xì)血管，降低血管阻力及血液黏度，改善微循環(huán)，對(duì)腦 缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，因此可用于缺血性腦血管疾 病的治療。黃小平等將三七的 3 種有效成分人參皂苷 Ｒg1、Ｒb1 以及三七皂苷 Ｒ1 分別與黃芪甲苷配對(duì)，然后注入 腦缺血模型小鼠后發(fā)現(xiàn)，注入人參皂苷 Ｒg1 的小鼠腦組織 中一氧化氮含量明顯降低，說(shuō)明人參皂苷 Ｒg1 具有抗腦缺 血的作用，對(duì)再灌注后氧化應(yīng)激損傷的亦有明顯的保護(hù) 作用。



 

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