１９５６年 英 國(guó) 學(xué) 者 Ｈａｒｍｎａ首 先 提 出 了 自 由 基 衰老學(xué)說。自由基衰老理論（ＦＲＴＡ）認(rèn)為細(xì)胞的老化變化是由自由基反應(yīng)引起的。１９９０年 美 國(guó) 衰 老研究權(quán)威Ｓｏｈａｌ教授指出了自由基衰老理論的缺陷，并首次提出了氧化應(yīng)激的概念。氧化 應(yīng) 激 即 機(jī)體自由基生成增加或清除能力降低，引起機(jī)體氧 化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的功能紊亂，導(dǎo)致自由基在體 內(nèi)積累而引起的一系列氧化損傷過程。多種研究 證明：氧化應(yīng)激不僅與衰老有著密不可分的關(guān)系，氧 化應(yīng)激還與腫瘤的發(fā)生，哮喘、抑郁癥及各種慢性炎 癥等疾病息息相關(guān)。氧化應(yīng)激還 參 與 心 血 管 疾 病的病理生理過程，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、 高血壓和心肌損傷等。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

傳統(tǒng)自制的發(fā)酵蔬菜：蘿卜、白菜、長(zhǎng)豇 豆 和 芥 菜；嬰兒糞便，采 集 于２５ｄ健 康 嬰 兒；ＭＲＳ液 體 培 養(yǎng)基：蛋白 胨 １０．０ｇ／Ｌ，牛 肉 膏 １０．０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０．０ｇ／Ｌ，檸檬酸二銨２．０ｇ／Ｌ，乙酸鈉５．０ｇ／Ｌ，硫酸鎂０．５８ｇ／Ｌ，硫 酸 錳０．２５ｇ／Ｌ，磷 酸 氫 二 銨２．０ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０．０ｇ／Ｌ，吐 溫－８０１ｍＬ；二 苯 基 苦 基 苯肼自由基（Ｓｉｇｍａ生物試劑有限公司）；ＤＮＡ 抽提 試劑盒，由生工生物工程（上海）股份有限公司出品； ＡＰＩ５０試劑條（生物梅里埃中國(guó)有限公司）；鄰菲羅 琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑（均為國(guó) 產(chǎn)分析純）。 生化培養(yǎng)箱（型 號(hào) 博迅SPX-250B-Z，上 海 博 迅 實(shí) 業(yè) 有限公司）；紫 外／可 見 分 光 光 度 計(jì)（型 號(hào) ＵＶ１０００， 上海天美科學(xué)儀器有限公司）；超聲波破碎儀（ＳＯＮ－ ＩＣＳ，型號(hào) ＶＣＸ５００）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Ｔｈｅｒ－ ｍｏ，型號(hào)Ｓｔｒａｔｏｓ）；聚合酶反應(yīng) 儀（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，型 號(hào) Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）。

１．２ 實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１ 樣品的采集

使用一次性無菌注射器采集發(fā)酵蔬菜的湯汁， 保存于已滅菌的 ＥＰ管中。對(duì)嬰兒糞便進(jìn)行無菌采 集，采樣后樣品封口膜封口，均保存于４ ℃?zhèn)溆谩?br />
１．２．２ 乳酸菌的分離純化

將樣品用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的 樣品均勻涂布于ｐＨ 為５．０的 ＭＲＳ固體培養(yǎng)基上， 放入３７ ℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)２４～４８ｈ。 觀察菌落形態(tài)，挑選符合乳酸菌形態(tài)的菌落進(jìn) 行３次劃線純化。對(duì)純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色 和接觸酶實(shí)驗(yàn)。革蘭氏染色陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)為陰 性的菌株可初步判定為乳酸菌。

１．２．３ 乳酸菌耐受性實(shí)驗(yàn)

１）乳酸菌的耐酸性測(cè)定：將活化后的菌株，以 ３％的接種量分 別 接 種 于 ｐＨ 為２．０，３．０，４．０，６．０ 的 ＭＲＳ液體培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)１６ｈ。１６ｈ后測(cè) 其在６００ｎｍ 處的吸光值。
２）乳 酸 菌 的 膽 鹽 耐 受 能 力 測(cè) 定：將 活 化 的 菌 株，以３％的接種量接種于分別含有０，０．３％，０．５％ 豬膽鹽的 ＭＲＳ液體培養(yǎng)基中，３７ ℃培養(yǎng)１６ｈ。１６ ｈ后測(cè)其在６００ｎｍ 處的吸光值。
３）乳酸菌的過氧化氫耐受能力測(cè)定：將活化的 菌株按３％接 種 于 過 氧 化 氫 濃 度 分 別 為 ０．４，０．７， １．０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭＲＳ液 體 培 養(yǎng) 基 中，３７ ℃培 養(yǎng)１６ ｈ。１６ｈ后測(cè)其在６００ｎｍ 處的吸光值。

１．２．４ 乳酸菌體外抗氧化能力測(cè)定

１）樣品的處理 樣品處理 參 考 Ｌｉｎ等的 方 法。完 整 細(xì) 胞 懸 液：將菌以１％接種于 ＭＲＳ液體培養(yǎng)基，３７ ℃培養(yǎng) １６ｈ后４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上清，收集 菌體，收集的菌體經(jīng) ＰＢＳ（ｐＨ 為７．
２）洗滌３ 次，再懸浮于 ＰＢＳ中，調(diào)整菌數(shù)至１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ。 胞內(nèi)提 取 物：將 上 述 菌 數(shù) 為１×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ 的 完整細(xì)胞懸液激進(jìn)行超聲破碎，功率４００ Ｗ，工作５ ｓ，停５ｓ，６０ 次。破碎后將懸液４ ℃，１００００ｒ／ｍｉｎ 離心１０ｍｉｎ，收集上清。 ２）ＤＰＰＨ 清除能力測(cè)定 ?。埃玻恚恚铮欤恚?的 ＤＰＰＨ１ｍＬ，加１ｍＬ 處 理過 的 乳 酸 菌 樣 品 充 分 混 勻 后，室 溫 避 光 反 應(yīng) ３０ ｍｉｎ，６０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清，測(cè)定其在波 長(zhǎng)５１７ｎｍ 處 的 吸 光 度 Ａｉ，對(duì) 照 組（ＡＯ ）以 等 體 積 ＰＢＳ 代 替 樣 品。 以 等 體 積 ＰＢＳ 和 無 水 乙 醇 調(diào) ０，其表達(dá)式為 清除率＝ＡＯ－Ａｉ ＡＯ ×１００％ ３）羥自由基清除能力測(cè)定 ?。保恚痰泥彿屏_琳（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），加入 ＰＢＳ １ｍＬ，蒸餾水１ｍＬ，充分混勻后加入１ｍＬ 硫酸亞 鐵（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），再次充分混勻，加１ｍＬ過氧化氫 （濃度為２０ｍｍｏｌ／Ｌ）。將上述反應(yīng)液于３７ ℃水浴 １．５ｈ后在５３６ｎｍ 處測(cè)定其吸光度 Ａｐ；用１ｍＬ蒸 餾水代替過氧 化 氫 為 Ａｂ；用１ｍＬ 樣 品 代 替１ｍＬ 蒸餾水為Ａｓ ，其表達(dá)式為 羥自由基清除率＝Ａｓ－Ａｐ Ａｂ－Ａｐ ×１００％ ４）抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定 在新鮮的雞蛋黃中１︰１加入 ＰＢＳ，磁力攪拌 １０ｍｉｎ后用 ＰＢＳ稀釋成１︰２５的蛋黃懸液。取１ ｍＬ蛋 黃 懸 液，０．５ ｍＬ 樣 品，１ ｍＬ ＰＢＳ 和 １ ｍＬ ＦｅＳＯ４（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液混勻，３７℃保溫１．５ｈ。然 后加入１ｍＬ三氯乙酸（ＴＣＡ，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為２．５％）， 室溫靜置１０ｍｉｎ，３５００ｒ／ｍｉｎ，離 心１０ｍｉｎ。取 上 清加入２ｍＬ 的 硫 代 巴 比 妥 酸（ＴＢＡ，質(zhì) 量 分 數(shù) 為 ０．８％），充 分 混 勻 后 沸 水 浴 １０ ｍｉｎ；冷 卻 后 于 ５３２ ｎｍ 處測(cè)定 吸 光 度 Ａ１。Ａ０ 用等量的樣品溶劑（即 ＰＢＳ）代替樣品，其表達(dá)式為 脂質(zhì)過氧化抑制率＝Ａ０－Ａ１ Ａ０ ×１００％ ５）還原活性分析 在０．５ｍＬ的菌懸液中依次加入０．５ｍＬＰＢＳ， ０．５ｍＬ鐵氰化 鉀（質(zhì) 量 分 數(shù) 為１％），５０ ℃水 浴２０ ｍｉｎ，迅 速 冷 卻 后 加 入 ０．５ ｍＬ１０％ 的 三 氯 乙 酸， ４０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ。取 上 清１ｍＬ 加 入１ｍＬ 蒸餾水和三氯 化 鐵（質(zhì) 量 分 數(shù) 為０．１％）混 合 均 勻， 反應(yīng)１０ｍｉｎ后于７００ｎｍ 處測(cè)定其吸光值，用 Ｌ－半 胱氨酸作為標(biāo)品。

１．２．５ 菌種鑒定

１）１６ＳｒＤＮＡ：將乳酸菌ＺＪ４０１過夜培養(yǎng)后，取適 量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用 １６Ｓ通用引物進(jìn)行ＰＣＲ（２７Ｆ：５＇－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧ－ ＧＣＴＣＡＧ－３＇；１４９２Ｒ：５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－ ３＇），將 ＰＣＲ 產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在 ＮＣＢＩ上進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對(duì)。 ２）ＡＰＩ５０ＣＨ菌種鑒定：用 ＡＰＩ５０ＣＨ及 ＡＰＩ５０ＣＨＬ 進(jìn)行乳酸菌的生理生化鑒定，操作步驟按照說明書進(jìn)行。 ３）生長(zhǎng)曲線分析：取５０ｍＬ 已發(fā)酵２４ｈ的菌 液離心棄上清，用生理鹽水洗滌后再離心棄上清，置 于烘箱中烘干至恒重（６５ ℃，２４ｈ），測(cè)其干重，以此 為依據(jù)分別計(jì)算出１，２，４，５，６，８，１０ｍＬ發(fā)酵液 的菌體干重。另?。?，２，４，５，６，８，１０ｍＬ菌液， 離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混 勻定容至 ２５ ｍＬ，分別測(cè)其 ＯＤ６００ｎｍ，得到吸光值 ＯＤ６００ｎｍ與菌體 干重的生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線。另以１％的接種量將乳酸 菌ＺＪ４０１接種于 ＭＲＳ液體培養(yǎng)基中，每隔２ｈ取一 定量菌液進(jìn)行ＯＤ６００ｎｍ測(cè)定和ｐＨ 測(cè)定。

１．２．６ 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)３ 次，采用 ＳＰＳＳ１９．０的單因素 方差分析顯著性差異。

２ 結(jié)果與討論

芬頓反應(yīng)是過氧化氫和二價(jià)鐵離子催化反應(yīng) 生成具有強(qiáng)氧化能力的羥基自 由 基，目 前 芬 頓 反 正也廣泛應(yīng)用于抗氧化能力的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中。乳酸菌要順利到達(dá)腸道，除了需要具有一定的耐 酸能力以外，還需要具有一定的膽鹽耐受能力，正常人 體腸道中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在０．０３％～０．３％波動(dòng)，乳酸菌 在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。ＤＰＰＨ（１，１－二 苯 基－２－三 硝 基 苯 肼）自 由 基 清 除實(shí)驗(yàn)常用于抗氧化能力的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中。當(dāng) 自 由 基 清 除 劑 存 在 時(shí)，ＤＰＰＨ 自由基接受一個(gè) 電子或 氫原子，形成穩(wěn)定的 ＤＰＰＨ－Ｈ 化合物，使 其 乙 醇 溶 液從深紫 色 變 為 黃 色，變色程度與其 接受的電子 數(shù)量（自由基清 除 活 性）成 定 量 關(guān) 系，因 而 可 用 分 光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。

３ 結(jié) 論

隨著科技進(jìn)步和生活水平的提高，細(xì)胞抗氧化 與抗衰老越來越多地為人們所關(guān)注。細(xì)胞氧化應(yīng)激 損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關(guān)系。本 實(shí)驗(yàn)從各種發(fā)酵食品中篩選得到３４株乳酸菌，經(jīng)耐 酸耐膽鹽及耐過氧化氫實(shí)驗(yàn)得到６株耐受性較好的 乳酸菌，通過 ＤＰＰＨ 清除率，羥自由清除率，還原活 性，抗脂質(zhì)過氧化率實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的體外抗氧化性進(jìn)行了鑒定，確定了一株具有優(yōu)良抗氧化性的短乳桿 菌，命名為ＺＪ４０１。ＺＪ４０１具備優(yōu)良的體外抗氧化活 性和益生性能，為后續(xù)乳酸菌的菌種選育，食品發(fā)酵 工業(yè)中功能性抗氧化食品發(fā)酵劑的研制，以及新型 的益生活菌制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

 

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