多藥耐藥病原菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐青 霉素肺炎鏈球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）、耐多藥結(jié)核分枝桿菌（multiple drugs resistant tuberculosis，MDR-TB）等革蘭氏陽(yáng)性菌和耐碳青霉烯類鮑 曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii， CRAB）、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）腸桿菌等革蘭氏陰性菌，其介導(dǎo)的感染性疾病是當(dāng)今世界需要亟待解決的健康安全問(wèn)題。

土樣：32份試驗(yàn)土樣采集于貴州遵義鳳凰山公園（10份）、 赤水丹霞山（12份）、大板水國(guó)家森林公園（10份）周邊人員 活動(dòng)較少地區(qū)、海拔500～1 000 m左右的除地表腐殖質(zhì) 10～20 cm的土層，分裝于無(wú)菌樣品采集袋中常溫保存運(yùn)輸。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）31：由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1 g，K2HPO4 ·3H2O 0.5 g，MgSO4 ·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 ·7H2O 0.01 g，玉米汁50 mL，土壤浸出物50 mL，土壤樣品細(xì)粉 10 g，復(fù)合維生素浸提物10 mL，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，115 ℃高壓滅菌30 min。其中玉米汁的制備：稱取新鮮 的玉米100 g，加入1 L蒸餾水，用豆?jié){機(jī)攪拌均勻后，濾掉 廢渣，補(bǔ)加蒸餾水至2 L，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌后于4 ℃冰 箱保存?zhèn)溆?；?fù)合維生素浸提物的制備：取21金維他多維 元素片20片（0.825 g/片）研磨成粉，入15 mL無(wú)水乙醇和35 mL無(wú)菌水振蕩懸浮，8 000 r/min離心10 min，上清用微 孔濾膜過(guò)濾除菌后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?土壤浸汁腐殖酸培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g， 微量元素預(yù)混液（ZnSO4 ·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4 ·7H2O 2 g/L， MnCl·2 4H2O 2 g/L，CuSO·4 5H2O 2 g/L，Na2B4O·7 10H2O 2 g/L， （NH4 ）6Mo7O2·4 4H2O 2 g/L）0.5 mL，腐殖酸2.0 g，瓊脂18 g， 土壤浸出物1 L，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌30 min。 國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃（international Streptomyces project， ISP）2培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，CaCO3 2 g，麥芽抽提物10 g，酵 母抽提物4 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃高壓滅菌 30 min。 改良的葡萄糖酵母麥芽（glucose yeast malt，GYM）鏈 霉素培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，CaCO3 2 g，麥芽抽提物10 g，酵 母抽提物4 g，微量元素預(yù)混液0.5 mL，腐殖酸浸出液10 mL， 瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃高壓滅菌30 min。 GYM液體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提 取物10 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃高壓滅菌30 min。 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。LB固體培 養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g。

抗生素、抗菌藥物儲(chǔ)存液（重鉻酸鉀50 mg/L，制霉菌 素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L）：德國(guó) Sigma公司；酚、氯仿等脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA）提取試劑：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯、甲 醇（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；Ex Taq酶（5 U/μL）、 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate， dNTP）Mixture、Taq Buffer等分子生物學(xué)試劑及酶類：寶 生物工程（大連）有限公司。

BSP-400培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公 司；E002092超級(jí)潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；Direct-Q5UV超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司；MLS3781L-PC自動(dòng)蒸汽滅菌器：日本松下公司；T100快速梯度 PCR儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó) 伯樂(lè)公司；DYCP-33A電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

土壤樣品預(yù)處理：每份樣品分別稱2 g于無(wú)菌研缽中， 加入0.2 g CaCO3，用無(wú)菌杵研磨成細(xì)粉，裝入50 mL無(wú)菌離 心管中，28 ℃風(fēng)干2周后，加入30 mL無(wú)菌水，置于28 ℃搖床 上150 r/min振蕩1 h使土壤充分懸浮，55 ℃處理20 min，促 使放線菌孢子萌發(fā)。 菌株的分離純化：采用梯度稀釋法將土壤預(yù)混液分別 稀釋成10-2 、10-3 和10-4 3個(gè)濃度梯度，振蕩混勻，分別吸取不 同濃度梯度的土樣懸濁液200 μL均勻涂布于4種放線菌分離培養(yǎng)基（改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基、土壤浸汁腐殖酸培養(yǎng)基、 ISP2培養(yǎng)基、改良的GYM鏈霉素培養(yǎng)基）上，28 ℃靜置培 養(yǎng)，隨時(shí)觀察培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取目的菌株進(jìn) 行分離純化并保藏。

從采集的32份土樣中共分離到169株放線菌菌株，其中赤水丹霞山土樣65株（以CS命名菌株）、鳳凰山公園土樣 45株（以FHS命名菌株）、大板水國(guó)家森林公園土樣59株 （以DBS命名菌株）。采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株的抗MRSA 活性進(jìn)行測(cè)定。不同分離菌株具有不同程度的抗MRSA 活性，且分離的169株菌株中有68株具有抗MRSA活性，占 總分離菌株的40.24%。因此，以68株活性抗MRSA菌株進(jìn) 行后續(xù)的基因組勘探。同時(shí)Blast比對(duì)中，菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株的16S rRNA 序列相似性＜98%，說(shuō)明本地區(qū)土壤放線菌中可能蘊(yùn)藏潛 在的較新穎菌株，具有開(kāi)發(fā)的潛力。CHRISTIANSEN G等指出鹵化酶基因、聚酮合酶基 因、非核糖體肽基因等可以作為指示基因?qū)ξ⑸锂a(chǎn)次級(jí) 代謝產(chǎn)物的潛力進(jìn)行快速評(píng)估。利用微生物的基因組信息 預(yù)測(cè)其合成特定天然產(chǎn)物的潛能，進(jìn)而進(jìn)行新化合物分離 純化和結(jié)構(gòu)鑒定的基因組挖掘技術(shù)。

本研究從32份土樣中共分離純化到169株放線菌，其 中68株菌株具有抗MRSA活性，占總分離菌株的40.24%。通 過(guò)16S rRNA序列分析可知，68株活性菌株主要為鏈霉菌 屬（Streptomycessp.），其中菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7 與 NCBI 的 Genbank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 已 有 菌 株 的 16S rRNA序列相似性＜98%，說(shuō)明本地區(qū)土壤放線菌中可 能蘊(yùn)藏潛在的較新穎菌株，具有開(kāi)發(fā)的潛力。 通過(guò)對(duì)68株活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因的勘探可 知，Hal陽(yáng)性菌株占17.65%，PKS I陽(yáng)性菌株占36.47%，PKS II 陽(yáng)性菌株占61.77%，NRPS陽(yáng)性菌株占32.35%，其中菌株 DBS9-1、DBS12-6、DBS8-13、DBS22-6、CSDG1-2、FHS5-10、 FHS10-22中同時(shí)含有NRPS或Hal、PKSI、PKSII三種基因， 本實(shí)驗(yàn)可為后續(xù)通過(guò)激活特定合成的基因組定向挖掘該 類化合物等研究提供參考。

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