急 性 淋 巴 細(xì) 胞 白 血 病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性血液系統(tǒng)腫瘤疾病， 也是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下，對(duì)患者健康危害嚴(yán)重 。 ALL 的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，對(duì)其機(jī)理目前尚未完 全明確。

材料和方法

試劑及儀器

TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；胎牛血清購(gòu) 自美國(guó) Hyclone 公司；ECL 試劑盒購(gòu)自武漢艾美 捷科技有限公司；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling 公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)密理博公司； 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶 科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上 海威奧生物科技有限公司；FACSCanto 流式細(xì)胞儀 購(gòu)自美國(guó) BD 公司；DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；PCR 系統(tǒng)購(gòu)自瑞士 Roche 公 司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精密儀器儀表 有限公司。

臨床標(biāo)本采集

2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年齡 8.9 ±2.3 歲， 參照張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行 診斷。患兒家屬均簽署知情同意書，且本研究經(jīng) 醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患兒的骨髓樣本均在治療 前采集，以防止藥物對(duì)骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分離液進(jìn)行密度梯度離心，以提取骨髓 單個(gè)核細(xì)胞（BMNC），置于液氮保存。 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養(yǎng)， 每 2-3 d 傳代 1 次。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟

將 BMNC 接種 至 24 孔 板， 分 為 對(duì) 照 組（Control 組），miR-221 陰 性 對(duì) 照 組（miR-221-NC 組）及 miR-221 轉(zhuǎn) 染 組（miR-221 組），待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)。 ALL 細(xì)胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 h，采用 TRIzol 試劑盒提 取細(xì)胞總 RNA，檢測(cè) RNA 純度后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè) miR-543 水平，以 U6 為內(nèi)參，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應(yīng)步驟為： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 個(gè)循環(huán)，采用 2- △△ Ct 法計(jì)算基因的相對(duì)水平。 miR-221 對(duì) ALL 細(xì)胞活力影響的 MTT 法檢測(cè) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于 96 孔板，每孔 150 μl，細(xì)胞 密度為 3×105 /ml，每組均設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，按照要 求轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 1、2、3、4 和 5 d，然后每孔加入 15 μl 的 MTT 試劑， 37 ℃條件下培養(yǎng) 2 h，棄培 養(yǎng)液后每孔加入 100 μl 的 DMSO，采用酶標(biāo)儀在 490 nm 處檢測(cè)各孔 OD 值。 miR-221 對(duì) ALL 細(xì)胞的細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞 術(shù)檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 h，用 PBS 清洗 3 次后，經(jīng) 70% 預(yù)冷的乙醇固定 12 h 后，制成密度為 1×105 /ml 的細(xì)胞懸液，加入 150 μl PI 染液避光孵育 30 min， 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。 miR-221 對(duì) ALL 細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種在 6 孔板，按要求轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 h，經(jīng) 1×binding buffer 清洗 3 次后，制成密度 為 1×105 /ml的細(xì)胞懸液，加入 5 μl Annexin V-FITC 避光孵育 10 min，清洗后用 500 μl 的 1×binding buffer 重懸細(xì)胞，加入 5 μl 的 PI 孵育 20 min 后上 機(jī)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè) ALL 細(xì)胞侵襲、遷移能力的 Transwell 檢測(cè) 首先在 Transwell 上室均勻鋪 100 μl 的 Matrigel 膠 （細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)此步驟），然后將各組細(xì)胞接 種于 Transwell 上室，每孔加入 100 μl，細(xì)胞數(shù)為 1×105 /ml，下室加入 500 μl 10％胎牛血清的培養(yǎng) 液中培養(yǎng) 24 h，取出小室后用棉簽拭去小室上層 膜上未穿模的細(xì)胞，經(jīng) 4% 的多聚甲醛固定 4 h 后， 采用 0.5% 結(jié)晶紫染色，經(jīng) PBS 洗滌 3 次后，在電 子顯微鏡下隨機(jī)選擇 5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。蛋白表達(dá)水平的 Western blot 檢測(cè) 收集各組細(xì)胞后經(jīng) RIPA 裂解液處理提取總蛋白， 經(jīng) BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。每孔上樣 15 μg 蛋白， 經(jīng) 10% SDS-PAGE 電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將分 離的蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，并采用 5% 脫脂奶粉室 溫下封閉 2 h，加入經(jīng)稀釋的 PCNA、Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9 蛋 白 一 抗，4 ℃ 孵 育 過(guò) 夜， TBST 清洗 3 次后，加入 HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育 2 h，使用 TBST 清洗 3 次后，經(jīng) ECL 試劑發(fā)光顯影， 拍照后采用 Quantity One 軟件分析條帶灰度值。 miR-221 靶向 Wnt 基因的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 檢測(cè) 利用 TargetScan 生物信息分析軟件預(yù)測(cè) miR-221 與 Wnt 基因的結(jié)合片段，通過(guò) PCR 技術(shù)將該片段擴(kuò) 增后插入熒光素酶載體構(gòu)建 Wnt 基因野生載體， 同時(shí)通過(guò)基因突變技術(shù)將該結(jié)合片段的部分核苷 酸隨機(jī)突變，用于構(gòu)建 Wnt 基因突變載體。采用 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 miR-221 mimic 和 Wnt 基因野生載 體或 Wnt 基因突變載體共轉(zhuǎn)染 BMNC 細(xì)胞，每組 設(shè)置 3 復(fù)孔，置于 37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng) 24 h， 按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光 素酶活性。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo) 準(zhǔn)差表示，采用 t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜ 0.05 示差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)染后各組 ALL細(xì)胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組 及 miR-221-NC 組（P＜ 0.05）（圖 1）。


討 論

ALL 是兒童時(shí)期較為常見(jiàn)的血液疾病，臨床癥狀 主要表現(xiàn)為免疫功能減弱、貧血、發(fā)熱及血小板 數(shù)量下降等 。在 ALL 治療過(guò)程中，由于需要長(zhǎng)期的化療干預(yù)，往往會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，對(duì)患兒健 康及生活也產(chǎn)生嚴(yán)重危害，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，兒 童急性淋巴細(xì)胞白血病治愈率較低，且容易復(fù)發(fā)， 嚴(yán)重影響治療效果。有文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌患者的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降，這與患者預(yù) 后密切相關(guān)。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細(xì) 胞中表達(dá)水平顯著下降，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中 miR-221 水平，可抑制癌細(xì)胞增殖及遷移。因此，需 進(jìn)一步分析 miR-221 對(duì) ALL 細(xì)胞抑制效果，以期 為提高患兒治療效果提供實(shí)驗(yàn)參考。